李赫 劉宗英 張健 胡宗云

摘?要：在草魚飼料中添加不同劑量的殼聚糖，連續(xù)投喂42 d，研究殼聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，殼聚糖可以提高血清溶菌酶活性、SOD活性、AKP活性、補(bǔ)體C3含量和血液白細(xì)胞吞噬活性，并能降低MDA含量。結(jié)果表明，飼料中添加5 g/kg的殼聚糖對草魚的非特異性免疫功能有最好的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：殼聚糖;草魚（Ctenopharyngodon idellus）;非特異性免疫

殼聚糖（chitosan，CS）又稱殼多糖，是由天然聚合物甲殼素經(jīng)過脫乙酰作用而得，通常將脫乙酰度大于70%的稱為殼聚糖，其優(yōu)點(diǎn)很多：良好的生物相容性、可自然降解性、粘膜吸附性、溶菌酶等可使其溶解、本身及其代謝物無任何毒副作用、調(diào)節(jié)生物體的免疫功能[1-3]。研究表明，殼聚糖對正常生理?xiàng)l件下和處于免疫功能低下的魚體的非特異性免疫功能均具有提高的功能[4-6]，添加適量的殼聚糖可以提高俄羅斯鱘幼魚的生長性能和免疫能力[7]。本試驗(yàn)通過在草魚（Ctenopharyngodon idellus）基礎(chǔ)飼料中分別添加不同劑量的殼聚糖，研究其對草魚免疫功能的影響，以期為預(yù)防草魚疾病提供新方法。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用草魚來自遼陽市東荒農(nóng)場，暫養(yǎng)后從中挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的魚350尾（平均體質(zhì)量108 g），用3%的食鹽水溶液消毒后，隨機(jī)分成5組（每組25尾），每組2個重復(fù)，放入10個（1.0 m×1.0 m×0.5 m）網(wǎng)箱中。設(shè)2個對照組。網(wǎng)箱放在7.5 m×7.5 m×1.5 m的水泥池中。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在基礎(chǔ)飼料（表1）中分別添加殼聚糖0 g/kg（C0組）、2.5 g/kg（C1組）、5 g/kg（C2組）、7.5 g/kg（C3組）、10 g/kg（C4組）。飼料原料經(jīng)粉碎過40目篩后制粒，然后破碎成直徑為3 mm的顆粒備用。飼料配制時，所添加的中藥免疫增強(qiáng)劑以等量減少麥麩用量保持配方平衡。對照組投喂基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料組成及成分分析見表1。

1.3?試驗(yàn)過程與飼養(yǎng)管理

在正式試驗(yàn)開始之前，將草魚先暫養(yǎng)兩周后轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱中。每天在早、中、晚三個時間投喂，投喂量為魚體重的4%。試驗(yàn)地點(diǎn)在遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地，試驗(yàn)周期為42 d。試驗(yàn)期間，控制水溫在23～28 ℃，DO保持在5 mg/L以上，氨氮小于0.3 mg/L。

1.4?非特異性免疫指標(biāo)的測定

1.4.1?樣品的采集?在第42天時進(jìn)行取樣，每箱取草魚3尾，于尾靜脈處采血，放入車載冰箱中保存，返回實(shí)驗(yàn)室后，于4 ℃下，2 500 r/min離心15 min，收集上層血清，立即測定。

1.4.2?血清指標(biāo)測定

溶菌酶活力按王雷等[8]的方法進(jìn)行測定，溶菌酶活性（U）由下式計(jì)算：U=（A0- A）/A0，A0為初始光密度值，A為反應(yīng)后光密度值。

超氧化物歧化酶活性、堿性磷酸酶活性、丙二醛采用南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。補(bǔ)體C3含量采用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

白細(xì)胞吞噬活性的測定，于草魚尾靜脈處采血500 μL（采血管和注射器均提前用1%肝素潤洗），加入200 μL嗜水氣單胞菌懸液（濃度為1×108 cfu/mL），渦旋30 s，37 ℃水浴30 min（同時每隔5 min輕輕振蕩一次，共振蕩4次），靜置10 min。從表面吸取上清進(jìn)行推片，自然干燥后，經(jīng)過固定、染色1 min后，用油鏡進(jìn)行觀察。以吞噬百分比計(jì)算吞噬活性。

吞噬百分比=（100個吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100）×100%。

1.5?數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為0.05。

2?結(jié)果

2.1?殼聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響

由表2可知，溶菌酶活性隨著殼聚糖添加量的增加而增大，其中殼聚糖添加量為10 g/kg的溶菌酶活性顯著高于對照組（P<0.05）;添加殼聚糖的超氧化物歧化酶活性均與對照組差異不顯著（P>0.05）;殼聚糖添加量為5 g/kg的堿性磷酸酶活性最高，且與對照組差異顯著（P<0.05），其余組別的堿性磷酸酶活性均與對照組差異不顯著（P>0.05）;殼聚糖添加量為5 g/kg和7.5 g/kg的丙二醛含量顯著低于對照組（P<0.05），其余組別的丙二醛含量均與對照組差異不顯著（P>0.05）;補(bǔ)體C3含量隨著殼聚糖添加量的增加而先增加后降低，試驗(yàn)組均高于對照組，其中殼聚糖添加量為5 g/kg時補(bǔ)體C3含量最高。

2.2?殼聚糖對草魚血液白細(xì)胞吞噬活性的影響

由圖1可知，白細(xì)胞吞噬活性隨著殼聚糖添加量的增加而先增加后降低，添加量為5 g/kg時達(dá)到最高，且試驗(yàn)組均顯著高于對照組（P<005）。

3?討論

溶菌酶在魚類的非特異性免疫系統(tǒng)中占有重要的地位，也是評價非特異性免疫的重要指標(biāo)，它對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的殺滅作用，其作用機(jī)制是將細(xì)胞壁中乙?；嗵撬獠⑨尫懦鰜?，從而將侵入體內(nèi)的異物進(jìn)行破壞和消除，起到機(jī)體防御的作用[9-10]。常青[11]等發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能夠提高花鱸機(jī)體的補(bǔ)體活性、增強(qiáng)溶菌酶活性和吞噬活性，并且還有一定的促生長作用。在本實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖添加量為10 g/kg的溶菌酶活性顯著高于對照組（P<0.05）;而低添加量組的溶菌酶活性低于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，使自由基的生成與清除處于一種動態(tài)平衡中，它還與生物的免疫功能有著密切的關(guān)系[12-14]。本實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)組的超氧化物歧化酶活性均略低于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。這與王秀華[15]的研究結(jié)果一致。AKP通過改變致病菌的表面結(jié)構(gòu)，來提高機(jī)體識別和吞噬致病菌的能力，進(jìn)而達(dá)到提高魚體免疫力的作用[9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖添加量為5 g/kg的組堿性磷酸酶活性最高，且與對照組差異顯著（P<0.05）。MDA的含量可以反映出機(jī)體遭受自由基攻擊的程度。在本實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖添加量為5 g/kg和7.5 g/kg時均可顯著降低MDA含量，過低和過高添加量對MDA含量沒有顯著影響。補(bǔ)體在非特異性體液免疫系統(tǒng)中有著特別重要的作用，而C3在補(bǔ)體中又有著重要作用，激活它可以起到殺菌、溶菌作用。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)殼聚糖添加量為5 g/kg時，草魚血清中補(bǔ)體C3的含量達(dá)到最高，但繼續(xù)增加殼聚糖，對補(bǔ)體C3含量反倒起到負(fù)作用，這與肖艷翼[7]和汪開毓[16]的研究結(jié)果相似。這說明，適量的殼聚糖可以激活草魚體內(nèi)補(bǔ)體C3的活性，增強(qiáng)草魚的非特異性免疫功能，而過量的殼聚糖反而抑制了補(bǔ)體C3的表達(dá)。

白細(xì)胞的吞噬功能是動物非特異性免疫的重要組成部分[10]，它有吞噬作用、胞飲作用和趨化作用，免疫增強(qiáng)劑可以增強(qiáng)水產(chǎn)動物的這些防御反應(yīng)。溫小波[17]等的研究結(jié)果表明，黃鱔白細(xì)胞的吞噬活性在0.5～1.5 g/100 g時最高，但當(dāng)殼聚糖的添加量達(dá)到2.0 g/100 g時，白細(xì)胞的吞噬活性明顯下降。曹志華[18]等的研究結(jié)果表明，添加5～20 g/kg殼聚糖能提高白細(xì)胞的吞噬活性和溶菌酶活性。陳勇[19]等和翟少偉[20]等認(rèn)為殼聚糖的添加量為5 g/kg時效果最好。在本實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖對草魚的白細(xì)胞吞噬活性有顯著的提高作用，添加量為5 g/kg時，白細(xì)胞吞噬活性最高，這與陳勇等人的研究結(jié)果一致。

綜上，在本試驗(yàn)條件下，殼聚糖能顯著提高草魚機(jī)體的免疫能力，建議飼料中適宜添加量為5 g/kg。

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Effect of chitosan on the non-specific immune response of grass carp，Ctenopharyngodon idellus （Cuvier et Valenciennes）

LI He， LIU Zongying， ZHANG Jian，HU Zongyun

（Freshwater Fisheries Science Institute of Liaoning Proivince，Liaoyang 111000，China）

Abstract：The effects of chitosan on the ability of the non-specifi response of the grass carp Ctenopharyngodon idellus were studied and lysozyme activity in serum， SOD activity in serum， AKP activity in serum， the content of serum complement C3， the content of MDA and the phagocytic activity of leukocytes were tested.It was found that， compared to the control group， the addition of chitosan could increase lysozyme activity in serum， SOD activity in serum， AKP activity in serum， the content of serum complement C3 and the phagocytic activity of leukocytes， decrease the content ofMDA.The results indicated that the ability of non-specific immune response of grass carp was enhanced by chitosa， and the chitosan supplement in diets was suggested to be 5 g/kg for grass carp.

Key words：chitosan;Ctenopharyngodon idellus;non-specific immune

（收稿日期：2020-05-07）