張蓓琳,黃玉偉,符策月,蔡雷鳴,王斌

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院消化內科，上海 200071)

近年來，隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和人們生活水平的提高，飲食結構發(fā)生改變，非健康行為人群中診斷為非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的概率明顯升高。NAFLD是排除乙醇及其他明確因素所致，以影像學或組織學形式表現(xiàn)出彌漫性大泡性肝細胞脂肪變性和直至貯存特征的臨床病理綜合征[1]。多數(shù)NAFLD患者的病理變化為單純性脂肪肝，是各種慢性肝病進展至終末期肝硬化的必經(jīng)階段[2]，因此早期診斷至關重要。

NAFLD嚴重威脅著患者生命健康。目前對NAFLD的診斷仍以病理肝活組織檢查結果為“金標準”，但后者因有創(chuàng)性操作而不適宜在臨床廣泛開展和應用，且費用較高，診斷結果可能因取樣部位等有一定的偏倚，對醫(yī)療機構的病理檢測水平也有一定的要求。Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ,PCⅢ)、透明質酸(hyaluronicacid,HA)等是臨床評估肝臟疾病患者病情進展及肝功能狀況的常用實驗室指標。研究發(fā)現(xiàn)，細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK-18)在肝細胞代謝中具有重要作用[3]。目前，尋求用于早期診斷NAFLD的無創(chuàng)性、可重復性的診斷價值高的指標，是臨床研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，不同病情程度的NAFLD患者血清CK-18 M30水平也不同[4]。因此，監(jiān)測CK-18 M30蛋白片段的表達水平對于判斷NAFLD的病情進展程度具有一定的臨床價值。不同病情程度的NAFLD患者肝纖維化實驗室指標的檢測結果也不同[5]。因此，本研究主要分析NAFLD不同病情程度與血清CK-18和肝纖維化指標的相關性，旨在為臨床早期評估NAFLD病情提供無創(chuàng)指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2018年8月上海市第一人民醫(yī)院寶山分院收治的100例NAFLD患者作為研究對象，按照NAFLD病情程度不同分為輕度組(37例)、中度組(33例)、重度組(30例)。病情程度劃分標準[6]：輕度為肝臟密度降低，肝、脾CT值比值0.7～1.0；中度為肝內血管不清，肝、脾CT值比值0.5～0.6；重度為肝臟密度明顯降低，肝、脾CT值比值≤0.5。選擇同期體檢健康的志愿者30名作為對照組。各組受試者性別、年齡、體質指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)上海市第一人民醫(yī)院寶山分院倫理委員會審核備案。

表1 各組受試者一般資料比較

NAFLD:非酒精性脂肪肝；a為χ2值，余為F值

1.2納入與排除標準 納入標準：①根據(jù)肝臟超聲、CT的檢查結果,符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[7]中 NAFLD的診斷標準。②年齡18～70歲。③患者均簽署了知情同意書。排除標準：①合并重要器官的功能障礙；②酒精性肝??；③病毒性肝炎、藥物性肝炎(甲氨蝶呤、糖皮質激素等所致)、自身免疫性肝病等其他原因所致的肝臟疾病；④合并急慢性感染、膽管疾病、免疫系統(tǒng)疾病，肝臟或其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；⑤精神類疾病，無法正常配合研究；⑥近期(<1個月)服用了可能影響肝細胞色素P450酶功能的藥物。

1.3方法 所有受試者于晨起空腹(8 h后)采集肘靜脈血4 mL，以離心半徑15 cm，3 000 r/min離心10 min，取1 000 μL上清液，保存于-70 ℃冰箱，待統(tǒng)一檢測(3個月內)CK-18及肝纖維化指標[PCⅢ、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ,CⅣ)、層粘連蛋白(laminin,LN)、HA]。①血清CK-18含量：根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測受試者血清CK-18含量，應用KHBST-360酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)，嚴格按照說明書操作，在450/540 nm波長下讀取吸光度(A)值，由標準曲線計算CK-18的含量(濃度)，檢測試劑盒購自美國R&D公司(批號：20140709)。②肝纖維化指標：根據(jù)電化學發(fā)光法和夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測受試者肝纖維化指標(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)，電化學發(fā)光法所用儀器為Centaur CP電化學發(fā)光免疫分析儀(美國拜耳公司)，嚴格按照說明書操作；夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法試劑盒購自北京晶美生物工程有限公司(批號：20140513)，并嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4觀察指標 比較各組血清CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA的表達水平，分析NAFLD患者病情程度與CK-18及肝纖維化指標的相關性。

2 結 果

2.1各組血清CK-18和肝纖維化指標的比較 各組血清CK-18和肝纖維化指標(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),NAFLD輕度、中度、重度組血清CK-18和肝纖維化指標高于對照組，NAFLD中度和重度組高于輕度組，NAFLD重度組高于中度組(P<0.05)。見表2。

2.2NAFLD病情程度與血清CK-18及肝纖維化指標的相關性分析 Spearman等級相關分析結果顯示，NAFLD病情程度與CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA均呈正相關(rs=0.618，P<0.001；rs=0.215，P=0.027；rs=0.506，P=0.004；rs=0.579，P<0.001；rs=0.528，P=0.001)。

3 討 論

目前，NAFLD發(fā)病率已超過酒精性肝病和病毒性肝病，但NAFLD的發(fā)病機制目前尚不完全明確，目前認為其與多種基因的遺傳、相關疾病、生活習慣、環(huán)境等因素有關，臨床尚無靶向治療藥物，但中心性肥胖與NAFLD嚴重程度密切相關。NAFLD病理特征主要為彌散性肝細胞大泡性脂肪變，無明確肝損傷,非長期飲酒所致。從病理類型劃分，NAFLD包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化。NAFLD患者肝內脂肪酸60%來自脂肪組織的非酯化脂肪酸、其余部分來自肝內脂肪生成和飲食中，早期NAFLD患者無明顯臨床癥狀[8]。在NAFLD病情發(fā)展中，肝細胞在脂質的長期浸潤下可發(fā)生變性、壞死，最終可形成肝組織纖維化，導致肝硬化[9]。NAFLD患者的最終臨床結局可能發(fā)展成肝細胞癌。因此，對于NAFLD的早期診斷極其重要。近年來,有關血清標志物診斷NAFLD的研究逐漸增多，研究熱點均集中在如何減少肝活組織檢查、開展無創(chuàng)的診斷和評估肝臟脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化疾病過程的臨床應用。

組別例數(shù)CK-18(ng/L)PCⅢ(μg/L)CⅣ(μg/L)LN(μg/L)HA(μg/L)對照組373.9±1.194.9±18.053.8±13.283.9±18.579.4±12.4NAFLD輕度組339.1±3.3a 116.2±26.8a57.8±12.1a98.6±27.5a82.6±17.4aNAFLD中度組3012.0±5.0ab128.2±29.6ab73.3±16.9ab112.1±25.2ab91.2±18.7abNAFLD重度組3013.7±5.3abc132.7±47.9abc86.2±23.9abc134.5±22.1abc122.4±25.8abc F值40.377 9.747 25.242 27.474 34.226P值<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

NAFLD:非酒精性脂肪肝；CK-18：細胞角蛋白18；PCⅢ：Ⅲ型前膠原；CⅣ：Ⅳ型膠原；LN：層粘連蛋白；HA：透明質酸；a與對照組比較，P<0.05；b與NAFLD輕度組比較，P<0.05；c與NAFLD中度組比較，P<0.05

NAFLD與胰島素抵抗及遺傳易感性相關[10-11]。以往研究表明，NAFLD發(fā)病由多重病因所致，包括高體質指數(shù)、高胰島素水平及甲狀腺水平異常等[12]。凋亡是肝細胞死亡的主要方式。CK-18可維持肝細胞正常結構、預防機械或非機械性的損傷,與肝細胞凋亡相關[13]。當肝細胞凋亡時，血循環(huán)中CK-18含量隨之升高，通過檢測CK-18可預測相關疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究結果顯示，NAFLD輕度、中度、重度組患者血清CK-18水平高于對照組(P<0.05)。萬艷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清中CK-18與丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶等呈正相關，能夠準確地反映患者病變狀態(tài)。本研究結果顯示，不同病情程度NAFLD患者的血清CK-18水平比較差異有統(tǒng)計學意義，說明在NAFLD病程發(fā)展過程中隨著隨著胰島素抵抗的進展，脂肪肝的病情逐漸加重，肝細胞凋亡程度加劇，因此CK-18在NAFLD病程發(fā)展過程中發(fā)生了顯著性變化。童明富等[16]研究報道，臨床可以通過檢測血清中CK-18表達水平來評估NAFLD的病情程度。此外，本研究Spearman等級相關分析結果顯示，NAFLD病情程度與血清CK-18呈正相關，提示臨床可以通過檢測血清CK-18評估NAFLD患者的病情程度。

肝纖維化幾乎出現(xiàn)于所有慢性肝損傷后，是一個動態(tài)過程，由肝實質細胞、肝星狀細胞、肝竇內皮細胞等多種細胞及涉及的一系列細胞因子相互作用共同介導肝纖維化進程，是向肝硬化進展的必經(jīng)階段，多種慢性肝臟疾病的共同病理過程，也是多種慢性肝臟疾病的重要病理特征[17-18]。NAFLD病程向肝硬化發(fā)展的過程，是一種因細胞外基質(如非膠原糖蛋白、蛋白多糖)膠原成分過度堆積的病理過程。因此，有學者指出，對NAFLD患者肝纖維化指標的檢測或可成為診斷NAFLD的重要指標[19-20]。本研究結果顯示，NAFLD輕度、中度、重度組肝纖維化指標(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)高于對照組(P<0.05)。肝纖維化指標中CⅣ、HA及LN均為血管和細胞的重要組成成分，能較敏感地反映肝纖維化狀況。此外，本研究中NAFLD中度和重度組肝纖維化指標高于輕度組，NAFLD重度組高于中度組(P<0.05)，說明隨著胰島素抵抗的不斷進展，NAFLD患者的肝功能呈不同程度的惡化，提示肝纖維指標可以反映NAFLD患者的肝纖維化程度。周琳等[21]探討非酒精性脂肪肝與血清CK-18、肝纖維化指標的相關性，結果表明CK-18對NAFLD臨床診斷具有一定價值，可作為NAFLD的獨立預測因素。本研究相關分析結果顯示，NAFLD病情程度與PCⅢ、CⅣ、LN、HA均呈正相關(P<0.05)，說明隨著病情加重，NAFLD患者的肝纖維化指標均升高。

本研究中對NAFLD患者的最終診斷綜合了實驗室指標，并非經(jīng)病理活組織檢查而確診，對納入的100例NAFLD患者未做病理性分組，故本研究對NAFLD患者的分組存在一定的局限性。另外，本研究樣本量較少，可能導致統(tǒng)計學結果的偏倚。

綜上所述，臨床可通過監(jiān)測血清CK-18及肝纖維化指標水平來診斷NAFLD患者肝纖維化的病變及評估其病情程度，具有無創(chuàng)、可重復性的優(yōu)點。