李建民，劉江，吳發(fā)印

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100)

雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱(chēng)雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤中提取鑒定出來(lái)的一種化合物，分子式為C20H24O6，水溶性較差。雷公藤?gòu)V泛生長(zhǎng)于我國(guó)南部和東南部山區(qū)，在傳統(tǒng)中醫(yī)用藥中具有悠久歷史。雷公藤組成成分復(fù)雜，而環(huán)氧化二萜類(lèi)化合物TP是目前眾多單體中研究最多的一種，相關(guān)分子機(jī)制也較為成熟[1]。TP在自身免疫系統(tǒng)疾病(如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3])中療效確切，臨床上常用的雷公藤片、雷公藤多苷片均含有TP活性成分。近年來(lái)，TP在抗腫瘤方面的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。

線粒體是真核細(xì)胞ATP代謝的主要場(chǎng)所，除為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等生物學(xué)行為供能外，還廣泛參與了細(xì)胞凋亡、腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展[4]，一旦線粒體功能出現(xiàn)紊亂可快速導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在TP缺乏明確的抗腫瘤機(jī)制及效應(yīng)靶點(diǎn)的背景下，現(xiàn)就近年來(lái)TP通過(guò)線粒體途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制予以綜述。

1 線粒體凋亡通路

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主動(dòng)過(guò)程，細(xì)胞凋亡分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡，而線粒體凋亡通路是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的主要調(diào)節(jié)通路[5]。線粒體凋亡通路以外膜通透性增加、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放為主要調(diào)節(jié)步驟。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激信號(hào)時(shí)，線粒體外膜通透性升高，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開(kāi)放，位于線粒體內(nèi)膜上的Cyt C釋放入胞質(zhì)，與凋亡蛋白酶刺激因子相互作用，引發(fā)胱天蛋白酶(caspase)9活化，從而開(kāi)啟級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游caspase-3、6等凋亡執(zhí)行蛋白[6]，引起細(xì)胞不可逆性凋亡。除Cyt C外，線粒體外膜還可釋放其他促凋亡相關(guān)因子[7]。

2 TP介導(dǎo)線粒體凋亡通路

2.1促進(jìn)線粒體凋亡相關(guān)因子表達(dá)

2.1.1p53 p53是常見(jiàn)的抑癌基因之一，其表達(dá)失衡常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移。p53在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞衰老中起核心作用。當(dāng)細(xì)胞處于DNA斷裂、癌基因激活或缺氧等不利條件下時(shí)，p53蛋白反應(yīng)性表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53的低水平或基礎(chǔ)水平有利于維持線粒體功能的穩(wěn)定。細(xì)胞內(nèi)氧自由基的清除需要超氧化物歧化酶的作用，后者能有效維持線粒體內(nèi)的氧化平衡。p53突變型細(xì)胞中錳超氧化物歧化酶的表達(dá)增加，其加強(qiáng)了線粒體膜電子鏈復(fù)合物的電子傳遞，導(dǎo)致線粒體呼吸作用增強(qiáng)，阻斷因活性氧類(lèi)(reactive oxygen species，ROS)蓄積引起的細(xì)胞凋亡[8]。p53可直接影響線粒體外膜的通透性，釋放促凋亡因子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。研究證實(shí)，TP具有激活肝癌細(xì)胞p53的能力[10]，并促進(jìn)p53從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至線粒體，從而反式激活B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族基因，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加。相反，使用p53拮抗劑可抵消TP誘導(dǎo)的p53過(guò)表達(dá)和Bcl-2家族基因轉(zhuǎn)錄，從而維持線粒體膜通透性，阻止細(xì)胞凋亡[11]。因?yàn)閜53主要為核蛋白，依賴(lài)于一系列的化學(xué)修飾才可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)發(fā)揮作用，而p53的核轉(zhuǎn)位過(guò)程常依賴(lài)于鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)對(duì)p53的泛素化能力，高水平的MDM2抑制p53從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)易位，促進(jìn)相關(guān)p53復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)降解[12]。近年來(lái)有學(xué)者開(kāi)始研究針對(duì)MDM2的靶向治療藥物，試圖阻斷MDM2與p53的相互作用[13]。免疫組織化學(xué)研究顯示，胃癌組織中的MDM2相較于正常組織、慢性胃炎組織及腸上皮化生組織處于高表達(dá)水平[14]；體外研究發(fā)現(xiàn)，TP能顯著抑制MDM2蛋白的表達(dá)，增加p53、caspase-3、caspase-9的表達(dá)，促進(jìn)AGS胃癌細(xì)胞凋亡，且不依賴(lài)p53途徑，該結(jié)果與TP介導(dǎo)的MDM2/蛋白激酶B途徑相關(guān)[15]。

2.1.2Bcl-2家族 Bcl-2家族在調(diào)節(jié)線粒體功能和外膜通透性上發(fā)揮核心作用，控制著促凋亡因子的釋放[16]。p53對(duì)線粒體膜通透性的改變依賴(lài)于與Bcl-2家族的交互作用。Bcl-2家族蛋白按功能可劃分為抑凋亡蛋白亞家族和促凋亡蛋白亞家族，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等屬于抑凋亡蛋白亞家族，而B(niǎo)cl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)和Bok屬于促凋亡蛋白亞家族，其中Bax/Bak是細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的核心調(diào)節(jié)因子。凋亡刺激產(chǎn)生后，Bax/Bak被激活并從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜處，線粒體外膜通透性改變，這一過(guò)程被視為Bcl-2家族調(diào)控線粒體凋亡的關(guān)鍵步驟[17]。目前發(fā)現(xiàn)Bax通過(guò)兩種方式改變線粒體外膜通透性。Bax介導(dǎo)與組成mPTP的腺苷轉(zhuǎn)位因子、電壓依賴(lài)性陰離子通道結(jié)合，開(kāi)放mPTP，釋放促凋亡因子。由于Bcl-2、Bcl-xL與Bax/Bak互為拮抗，故抑凋亡蛋白亞家族Bcl-2、Bcl-xL可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腺苷轉(zhuǎn)位因子以阻止Bax的凋亡效應(yīng)。Bax和Bak耦合的寡聚結(jié)構(gòu)在介導(dǎo)線粒體外膜的激活中起至關(guān)重要的作用。活性Bax或Bak經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)象變化后，形成的二聚體或更高級(jí)的低聚物可部分組成或完全組成線粒體外膜上的異質(zhì)孔，這些膜孔的大小、壽命取決于Bax/Bak的密度[18]。此外，異質(zhì)孔也能增加線粒體外膜的通透性[18]。TP具備上調(diào)Bcl-2家族促凋亡蛋白亞家族、下調(diào)抑凋亡蛋白亞家族的能力。Ni等[19]發(fā)現(xiàn)，TP可通過(guò)下調(diào)Bcl-2抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。針對(duì)紫杉醇耐藥型肺癌A459細(xì)胞的研究顯示，TP介導(dǎo)糖原合成酶激酶-3β、Bax、caspases-3、 caspases-9的上調(diào)增加腫瘤敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Ma等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，TP可有效上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，TP通過(guò)上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)介導(dǎo)線粒體途徑，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡[22]。

2.1.3Cyt C與casepase家族 正常狀態(tài)下，Cyt C位于細(xì)胞線粒體的外膜內(nèi)，主要參與呼吸作用、能量代謝，其可通過(guò)外膜進(jìn)入胞質(zhì)。當(dāng)各種信號(hào)分子引起外膜通透性增加時(shí)，成熟的Cyt C受多層調(diào)控機(jī)制作用后進(jìn)入胞質(zhì)，引起caspase級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，參與細(xì)胞凋亡[23]。線粒體外膜通透性介導(dǎo)的凋亡依賴(lài)于caspase蛋白的活化[24]。caspase家族是一組特異性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，廣泛參與了真核細(xì)胞凋亡，負(fù)責(zé)線粒體凋亡途徑的最后一環(huán)。當(dāng)處于上游的啟動(dòng)者caspase-9接收信號(hào)激活后，通過(guò)異源活化可將凋亡信號(hào)放大，使處于下游的凋亡執(zhí)行者caspase-3/7顯著活化?；罨腸aspase可靶向切割細(xì)胞內(nèi)諸多生物酶結(jié)構(gòu)中的天冬氨酸殘基肽鍵，使酶失活，引起細(xì)胞不可逆凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，TP可使Cyt C的釋放增加、活化caspase水平升高[25-26]。TP對(duì)低分化癌細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷力，用TP處理低分化胃腺癌細(xì)胞24 h后，caspase-3/7的表達(dá)量較中分化腺癌高約3倍[27]。

2.2抑制線粒體相關(guān)抗凋亡蛋白表達(dá)

2.2.1Sp1與熱激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70) Sp1是一種核轉(zhuǎn)錄基因，參與部分生存必備基因的轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之一為HSP70。HSP70參與蛋白質(zhì)的合成、修復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡[28]。HSP70大量存在于腫瘤細(xì)胞的線粒體中，在大部分正常組織的線粒體中表達(dá)水平非常低[29]。一旦HSP70的表達(dá)出現(xiàn)抑制，將導(dǎo)致電子傳輸鏈組件中幾種線粒體編碼RNA的水平降低，腫瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體電子傳遞鏈配合物蛋白出現(xiàn)變性，膜電位喪失，耗氧率降低、ATP生成減少，引起細(xì)胞凋亡[30]。有研究表明，TP與光霉素(一種Sp1化學(xué)抑制劑)的作用效果類(lèi)似，具備抑制Sp1，下調(diào)HSP70表達(dá)的能力[27]。當(dāng)應(yīng)用pCMV-Sp1(Sp1激動(dòng)劑)后，胃癌細(xì)胞系Sp1的表達(dá)增加，抵消了TP的抗癌效應(yīng)[27]，說(shuō)明TP具有靶向抑制Sp1和HSP70的作用。HSP70在惡性腫瘤細(xì)胞中常呈高表達(dá)狀態(tài)，尤其是在低分化細(xì)胞株中，且與腫瘤的耐藥性呈正相關(guān)[31]。有學(xué)者認(rèn)為，TP可作為HSP70的抑制劑，通過(guò)抑制HSP70增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞系MKN5/AR對(duì)阿帕替尼(新型胃癌靶向藥物)的敏感性[32]。單獨(dú)應(yīng)用阿帕替尼時(shí)，與MKN5(敏感系)相比，MKN5/AR(耐藥系)細(xì)胞內(nèi)的HSP70表達(dá)水平升高，對(duì)MKN5/AR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為70.527 μmol/L；聯(lián)用小劑量TP后，阿帕替尼對(duì)MKN5/AR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為11.679 μmol/L，且低濃度的TP對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響[32]。以上研究證實(shí)，TP具備抑制HSP70、逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥、高效低毒的抗腫瘤活性。

2.2.2沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silent information regulator 3,SIRT3) SIRT3是sirtuin家族成員之一，是依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶，主要定位于線粒體，通過(guò)去乙?；揎椃磻?yīng)底物(組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶)，調(diào)控細(xì)胞的代謝、癌變、衰老、干細(xì)胞分化、上皮間-充質(zhì)轉(zhuǎn)化等細(xì)胞生理活動(dòng)[33]，具備延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的功能。在線粒體中，SIRT3調(diào)節(jié)代謝、能量穩(wěn)態(tài)和線粒體生物合成，通過(guò)去乙?；饔迷鰪?qiáng)脂肪酸β-氧化，導(dǎo)致乙酰輔酶A生成增多，促進(jìn)三羧酸循環(huán)，增加ATP的生成[34]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可激活檸檬酸合酶，促進(jìn)乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)[35]。除增強(qiáng)能量代謝外，SIRT3還調(diào)控mPTP的關(guān)閉，維持線粒體外膜通透性，減少Cyt C、凋亡誘導(dǎo)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)[36]。同時(shí)，SIRT3還可通過(guò)清除ROS、調(diào)控抗氧化酶的激活抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，維護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[37]，抑制動(dòng)力相關(guān)蛋白-1(dynamic-related protein 1,Drp1)向線粒體移位[38]，保護(hù)線粒體完整性，改善相關(guān)因子對(duì)線粒體損害作用。Yang等[39]的研究顯示，SIRT3通過(guò)關(guān)閉mPTP，抑制TP依賴(lài)線粒體凋亡途徑，挽救細(xì)胞。用TP處理p53缺陷的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，TP能減弱線粒體SIRT3的表達(dá)，導(dǎo)致電子傳遞鏈配合物Ⅰ和Ⅱ(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶復(fù)合物和琥珀酸脫氫酶)高乙?；?，改變線粒體膜電位；過(guò)表達(dá)SIRT3能恢復(fù)線粒體功能，拮抗TP對(duì)細(xì)胞的凋亡作用[40]。但Kong等[41]的研究顯示，TP介導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的凋亡與TP上調(diào)SIRT3的表達(dá)有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶-3β被SIRT3介導(dǎo)的去乙?；せ詈?，引起線粒體易位和Bax積累，并降低線粒體膜電位，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Kong等[41]認(rèn)為，TP可能通過(guò)增加SIRT3的表達(dá)，激活SIRT3/糖原合成酶激酶-3β/Bax途徑，觸發(fā)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞中的線粒體凋亡途徑。SIRT3可能在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起雙重作用[42]。也有學(xué)者認(rèn)為，SIRT3在癌癥中所起的作用取決于細(xì)胞環(huán)境[43]，如含高水平ROS的癌細(xì)胞具備更強(qiáng)的侵襲力和耐藥性，此時(shí)SIRT3起降低ROS水平的作用，發(fā)揮抗癌效應(yīng)；當(dāng)ROS過(guò)量蓄積，產(chǎn)生氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的環(huán)境下，SIRT3起維持ROS平衡，保護(hù)癌細(xì)胞的作用[44]?？梢?jiàn)，TP可能具備在不同細(xì)胞環(huán)境中依賴(lài)線粒體途徑發(fā)揮抗腫瘤的個(gè)性化能力。

2.3介導(dǎo)氧化應(yīng)激及能量代謝失衡 氧化應(yīng)激是細(xì)胞氧化還原的失衡狀態(tài)，呈過(guò)氧化表現(xiàn)。當(dāng)線粒體膜的完整性、跨膜電位、呼吸鏈等受干擾可引發(fā)ROS大量生成，引起氧化應(yīng)激，損害細(xì)胞器，加速細(xì)胞凋亡[45]。ROS是氧化應(yīng)激過(guò)程的核心，其能否被有效清除決定氧化應(yīng)激是否發(fā)生。在部分腫瘤細(xì)胞中，線粒體呼吸作用相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，需要依賴(lài)糖酵解途徑產(chǎn)生更多的ATP[46]。相較于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞的糖酵解、氧化磷酸化反應(yīng)增強(qiáng)，ROS減少，癌細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)[47]。抑制糖酵解[48]和底物氧化磷酸化[49]過(guò)程可減少癌細(xì)胞能量的產(chǎn)生，這也是一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要方法。氧化應(yīng)激與能量代謝失衡密切相關(guān)，TP可降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶復(fù)合物和琥珀酸脫氫酶的活性，抑制氧化磷酸化過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)ROS的消耗減少，ROS蓄積，能量生成減少，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40]。Liu等[50]研究發(fā)現(xiàn)，TP可上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)，阻斷蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路。蛋白激酶B通過(guò)磷酸化糖原合成酶激酶-3β而抑制后者的活性，增強(qiáng)糖代謝反應(yīng)。TP可通過(guò)抑制蛋白激酶B相關(guān)途徑，抑制糖代謝，同時(shí)促進(jìn)ROS產(chǎn)生，引起癌細(xì)胞氧化應(yīng)激、能量失衡。Xi等[51]認(rèn)為，TP可有效抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，減少ATP生成。ATP的釋能反應(yīng)依賴(lài)于ATP酶的水解作用，研究證實(shí)，TP可阻止ATP酶與ATP結(jié)合，抑制ATP酶活性[52]。

2.4介導(dǎo)線粒體融合與分裂 線粒體結(jié)構(gòu)的完整與穩(wěn)定是保障其功能的根本。在正常細(xì)胞內(nèi)，線粒體處于分裂與融合共存的動(dòng)態(tài)平衡中，這一狀態(tài)是線粒體實(shí)現(xiàn)功能的基礎(chǔ)[53]。在哺乳動(dòng)物中，線粒體的分裂與融合依靠線粒體融合蛋白(線粒體融合蛋白1和2)和線粒體分裂蛋白(Drp1)的作用。線粒體融合蛋白能融合線粒體內(nèi)呈嵴形狀的內(nèi)膜，擴(kuò)大膜面積，從而立體地增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化功能；而線粒體分裂蛋白Drp1可聚集在線粒體外膜上，使線粒體外膜局部裂解，增加線粒體外膜通透性，使Ca2+外流，ROS蓄積，促進(jìn)凋亡因子釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，TP是依賴(lài)線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，給予TP后可以觀察到線粒體變性、斷裂、線粒體去極化、ROS過(guò)度生成、ATP生成減少[54-55]。這個(gè)過(guò)程與TP可靶向調(diào)節(jié)線粒體融合蛋白與分裂蛋白有關(guān)[56]。Hasnat等[54-55]研究發(fā)現(xiàn)，TP以Drp 1蛋白為靶點(diǎn)，促使Drp1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜上，引起Cyt C釋放。Zhang等[57]發(fā)現(xiàn)，TP可調(diào)控小鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)線粒體融合蛋白2呈低表達(dá)狀態(tài)。綜上可知，TP可促進(jìn)線粒體外膜分裂，抑制線粒體膜融合。

3 小 結(jié)

TP因具有明確、廣泛的抗腫瘤活性而得到學(xué)者們的普遍認(rèn)可。TP的抗腫瘤作用依賴(lài)于線粒體凋亡途徑，其以線粒體為核心，升高線粒體外膜通透性為基點(diǎn)，相關(guān)因子為效應(yīng)靶點(diǎn)，引起線粒體生物功能及結(jié)構(gòu)紊亂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。TP介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑與凋亡相關(guān)因子變化、ROS蓄積、能量代謝紊亂、線粒體膜結(jié)構(gòu)分裂等線粒體生物過(guò)程密不可分，最終引起線粒體膜通透性增加，Cyt C等促凋亡因子釋放入細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞不可逆性凋亡。未來(lái)需要進(jìn)一步深入研究TP在線粒體凋亡途徑上的作用靶點(diǎn)、基因轉(zhuǎn)錄以及修飾等，以期更加詳盡地了解TP的抗腫瘤機(jī)制。