劉 敏，申鎬源，馬 歡，龐小溪，霍 焱，趙光宇，孫宏偉，王榮福，張春麗

北京大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100034

血栓栓塞性疾病，如心肌埂塞、腦中風(fēng)和肺栓塞等在全球的病死率居高不下。約一半的深靜脈血栓(deep venous thrombosis, DVT)形成后會(huì)脫落，是導(dǎo)致肺動(dòng)脈血栓栓塞的主要原因。DVT年發(fā)病率約0.1%，最常發(fā)生于小腿和大腿深靜脈內(nèi)，但也可發(fā)生在上肢深靜脈、內(nèi)臟靜脈甚至腔靜脈中[1]。早期準(zhǔn)確定位血栓位置可預(yù)防血栓脫落造成栓塞，對(duì)DVT患者有重要的臨床意義。

靜脈血栓核素顯像分為非特異(如99Tcm-MAA)和特異(如抗纖維蛋白抗體、抗血小板抗體、RGD肽等)放射性核素顯像。由于抗體在血液循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)、在肺內(nèi)的放射性聚積時(shí)間較長(zhǎng)，因此臨床應(yīng)用受限。而小肽段的顯像劑可從血液循環(huán)中很快被清除。CREKA肽由Simberg等[2]通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得，可特異性結(jié)合纖維蛋白-纖維連接蛋白復(fù)合物，用于血栓形成早期、腫瘤微環(huán)境、動(dòng)脈粥樣硬化及心肌缺血再灌注研究[3-4]，含CREKA肽的納米顆粒被報(bào)道用于急性血栓的核磁共振-超聲-光聲多模態(tài)成像研究中[5]。

本研究使用放射性核素131I標(biāo)記含CREKA的八肽YSSCREKA，對(duì)其在動(dòng)物模型中的早期血栓顯像及體內(nèi)生物分布進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

YSSCREKA八肽，上海吉爾生化有限公司；Sephadex G10柱顆粒，Pharmacia Biotech公司；牛血清白蛋白(蛋白質(zhì)含量>98%)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所；Na131I，北京原子高科股份有限公司；氯胺-T(化學(xué)純，純度98%)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、無水乙醇、氨水(14.8 mol/L)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)及其他化學(xué)試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

RM905型放射性活度儀, 中國計(jì)量科學(xué)研究院; FT-163γ井型計(jì)數(shù)器，北京核儀器廠；FA1104電子天平,精度0.1 mg，上海精科天平公司; 微量加樣器(10 μL、200 μL、1 mL)、5415D臺(tái)式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；MDF-U52V型-80 ℃超低溫冰箱，日本SANYO公司；電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械三廠；GZ-1多角振蕩器，北京冰箱電機(jī)廠。

SD大鼠(200～300 g)、新西蘭家兔(2～3 kg)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 131I-YSSCREKA的制備

1.2.1131I-YSSCREKA的標(biāo)記及純化 YSSCREKA多肽序列由上海吉爾生化有限公司通過Apex396全自動(dòng)高通量多肽合成儀采用固相合成法合成，在CREKA肽的半胱氨酸端加酪氨酸及D型絲氨酸，形成Y-(D)Ser-(D)Ser-CREKA八肽，以便被131I碘化標(biāo)記。用氯胺-T法進(jìn)行131I標(biāo)記。將200 μg YSSCREKA八肽溶于100 μL pH=7.4 的0.5 mol/L磷酸鹽(PB)緩沖液中備用，在EP管中依次加入0.5 mol/L PB緩沖液50 μL、YSSCREKA八肽溶液25 μL、Na131I 溶液34.8～88.8 MBq(0.94～2.4 mCi) 50 μL、氯胺-T溶液, 使氯胺-T在混合液中的質(zhì)量濃度為0.9 g/L，總反應(yīng)體積不超過200 μL。將混合液放入振蕩器，室溫振蕩5 min。將混合液通過經(jīng)10%牛血清白蛋白飽和的Sephadex G10柱分離純化，用pH=7.4的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，用EP管收集淋洗液，每管0.5 mL，依次測(cè)定各EP管的放射性計(jì)數(shù)，第一個(gè)計(jì)數(shù)高峰為131I-YSSCREKA。

1.2.2131I-YSSCREKA標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及體外穩(wěn)定性的測(cè)定 在混合物過Sephadex G10柱前及過柱后第一個(gè)計(jì)數(shù)高峰EP管中取少量待測(cè)液體，通過放射性紙層析法分別得到標(biāo)記率及放射化學(xué)純度。將純化后的131I-YSSCREKA溶液置于室溫(25 ℃)中，分別在0、1、3、6、24、48、72 h后通過放射性紙層析法測(cè)定其穩(wěn)定性。展開劑為正丁醇、無水乙醇和0.5 mol/L氨水，體積比為5∶1∶2，131I-YSSCREKA的比移值(Rf)為0～0.1。

1.3 動(dòng)物模型的建立

1.3.1SD大鼠靜脈血栓模型的建立 SPF級(jí)SD大鼠25只，性別不限，5～10周齡，體重200～300 g，在屏障環(huán)境內(nèi)用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)戊巴比妥鈉以50 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，備皮，打開腹腔，在腹腔后壁分離下腔靜脈，在其外壁敷1.5 cm×0.1 cm質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 25% FeCl3溶液的濾紙條約15 min，促進(jìn)血管內(nèi)壁血栓形成。取出濾紙，關(guān)閉腹腔，飼養(yǎng)2 d，期間飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% NaI的水，封閉甲狀腺及胃腸道粘膜。

1.3.2兔靜脈血栓模型的建立 普通級(jí)新西蘭家兔3只，性別不限，體重2～3 kg，用3%戊巴比妥鈉以1 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注入麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，備皮，打開腹腔，在右腎下極以遠(yuǎn)約3 cm處尋找下腔靜脈，在其內(nèi)置入長(zhǎng)約1.5 cm的單股螺旋銅絲，縫合血管，止血，觀察下腔靜脈血液回流通暢后關(guān)閉腹腔，飼養(yǎng)2 d，期間飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% NaI的水，封閉甲狀腺及胃腸道粘膜。

1.4 SD大鼠體內(nèi)生物分布

取下腔靜脈血栓造模后2 d的SD大鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。前4組經(jīng)尾靜脈分別注射131I-YSSCREKA 3.7 MBq，分別于注射后6、12、20、48 h眼球取血100 μL后斷頸處死大鼠。第5組為阻斷組，在注射131I-YSSCREKA前30 min注射YSSCREKA肽50 μg，使無放射性的YSSCREKA肽與血栓位點(diǎn)結(jié)合，于20 h眼球取血100 μL后斷頸處死大鼠。剝離血栓、取其主要臟器組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃壁、小腸壁、膀胱、股骨、肌肉、血液)并稱重。γ井型計(jì)數(shù)儀測(cè)定各器官或組織的放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)源校正，計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)，并計(jì)算血栓與各組織器官的放射性比值，并對(duì)20 h未阻斷組與20 h阻斷組血栓對(duì)131I-YSSCREKA的攝取及血栓/血比值進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

1.5 活體動(dòng)物單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層(SPECT)顯像

兔血栓造模后2 d經(jīng)耳緣靜脈注入14.8 kBq/g131I-YSSCREKA，分別在注射后1、2、6、12、20、48 h行全身靜態(tài)SPECT顯像。SPECT儀采用高能通用準(zhǔn)直器，采集時(shí)設(shè)置能峰360 keV，窗寬20%，1 000 k計(jì)數(shù)，矩陣128×128。在注射后20 h的血栓部位影像中勾畫血栓處感興趣區(qū)(region of interest, ROI)，在血栓上方的下腔靜脈選取與血栓等面積的ROI，計(jì)算血栓部位與血液的放射性比值(T/B)。

2 結(jié)果與討論

2.1 131I-YSSCREKA的標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及穩(wěn)定性

標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物采用放射性紙層析法測(cè)得的標(biāo)記率為(77.2±1.1)%，經(jīng)Sephadex G10柱純化后放射化學(xué)純度為(90.0±3.1)%。放射性比活度為(643.4±232.1) MBq/mg，放射性活度濃度為(29.3±11.3) MBq/mL。0～72 h131I-YSSCREKA在室溫下磷酸鹽溶液中的放射化學(xué)純度示于圖1，前24 h放射化學(xué)純度大于80%，72 h放射化學(xué)純度大于75%，說明131I-YSSCREKA在體外穩(wěn)定性較高。

圖1 131I-YSSCREKA的體外穩(wěn)定性Fig.1 In vitro stability of 131I-YSSCREKA

2.2 SD大鼠體內(nèi)生物分布

對(duì)每組下腔靜脈血栓SD大鼠分別測(cè)量每克組織百分注射劑量率，計(jì)算血栓與其他組織放射性比值，生物分布結(jié)果列于表1。由表1可以看出：放射性示蹤劑在血液中6 h時(shí)的放射性攝取為(0.44±0.05)%ID/g，12 h時(shí)為(0.12±0.04)%ID/g，血液清除較快；示蹤劑在腎、膀胱積聚較高，在肝積聚低，表明131I-YSSCREKA主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄。示蹤劑在胃積聚較高，尤其12 h可達(dá)(0.74±0.19)%ID/g，但隨時(shí)間延長(zhǎng)放射性攝取逐漸下降。注射后不同時(shí)間血栓與各組織的放射性比值列于表2。由表2可以看出：血栓/肌肉維持較高的放射性比值，血栓/血液放射性比值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，在20 h時(shí)其比值達(dá)1.9，與48 h比值相近，但48 h血栓內(nèi)131I-YSSCREKA放射性攝取僅為(0.04±0.01)%ID/g，在SPECT上與注射后20 h相比更加難以探測(cè)信號(hào)。與20 h未阻斷組相比，20 h阻斷組血栓對(duì)131I-YSSCREKA的攝取降低，t檢驗(yàn)P=0.03；血栓/血放射性攝取比值從1.90降至0.85，t檢驗(yàn)P<0.001。

表1 131I-YSSCREKA在SD大鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 Biodistribution of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus

注：n=5

表2 在大鼠血栓模型中注射131I-YSSCREKA后不同時(shí)間血栓與各組織的放射性比值(T/NT)Table 2 T/NT of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus at different time post injection

注：n=5

2.3 家兔血栓SPECT顯像

箭頭所指為血栓部位圖2 家兔血栓模型注射131I-YSSCREKA 20 h后的SPECT顯像Fig.2 SPECT images of rabbit with vein thrombus after 20 h 131I-YSSCREKA injection

131I-YSSCREKA肽在3只兔中均于注射后20 h左右血栓部位出現(xiàn)放射性聚集，至48 h時(shí)逐漸減淡至消失，與YSSCREKA肽在體內(nèi)被酶降解有關(guān)。圖2顯示家兔注射顯像劑131I-YSSCREKA后20 h的SPECT圖像，箭頭所指為血栓部位。20 h的血栓/血的T/NT值為1.36。

3 結(jié) 論

131I-YSSCREKA多肽在室溫下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記率為(77.2±1.1)%(n=3)，放射化學(xué)純度為(90.0±3.1)%(n=3)，體外穩(wěn)定性較好。131I-YSSCREKA對(duì)血栓有較高的選擇性，心、肝、脾、肺、骨、肌肉等組織對(duì)其攝取低，131I-YSSCREKA有望成為一種新型早期血栓顯像劑。