王 琦，溫婧玉，趙玉杰，楊 燁，朱家超，穆 莉*，劉瀟威*，康為露

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191；2.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

近年來，含砷灌溉水的使用導(dǎo)致砷污染農(nóng)田大面積出現(xiàn)，農(nóng)田中的砷進(jìn)一步通過食物鏈傳遞對(duì)人體健康造成危害[1-2]。砷的生物毒性不僅取決于生物體中砷的含量，而且與砷的形態(tài)密切相關(guān)，砷可分為無機(jī)砷、有機(jī)砷和單質(zhì)砷，其中單質(zhì)砷溶解度較低，不易被人體吸收[3]，而無機(jī)砷的毒性大于有機(jī)砷[1]。在土壤與水環(huán)境中，可溶性砷形態(tài)主要為砷酸鹽As（Ⅴ）和亞砷酸鹽As（Ⅲ），在有氧條件下，As（Ⅴ）占主導(dǎo)地位[4]，因此本研究選取砷酸鹽作為主要研究對(duì)象。生菜具有重要的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，現(xiàn)已成為設(shè)施農(nóng)業(yè)和植物工廠的主要種植對(duì)象之一[5]。本研究選取生菜作為研究對(duì)象，采用可以排除復(fù)雜土壤環(huán)境影響的水培方式[6]，從砷酸鹽的生菜積累以及對(duì)其安全品質(zhì)影響方面開展研究。

腐植酸（Humic acid，HA）是一種天然存在的高絡(luò)合和聚合有機(jī)物，其豐富的含氧官能團(tuán)（例如羧酸、酚羥基和醌官能團(tuán)[7]）可以絡(luò)合許多金屬[8]。本研究所采用的腐植酸中的黃腐酸（富里酸）含量≥90%，其分子結(jié)構(gòu)中存在含氧活性基團(tuán)，如羧基和酚羥基，同時(shí)還含有雜氮環(huán)，所以有離子交換性和與金屬離子形成螯合物的能力，另外含有的醌基和半醌基具有一定的氧化還原能力[9]。黃腐酸能使作物根系發(fā)達(dá)，次生根數(shù)量增多，提高作物吸水力，并能降低葉面蒸騰作用，提高葉綠素含量，促進(jìn)光合作用[10]。此外，腐植酸還可以提高植物肥力，改善植物生長[11-12]。因此，本研究進(jìn)一步選取腐植酸對(duì)砷的植物毒性進(jìn)行調(diào)節(jié)，旨在從生菜中砷的安全限量的角度，探究蔬菜中砷的累積規(guī)律以及砷和腐植酸對(duì)蔬菜的毒性調(diào)節(jié)作用，為蔬菜質(zhì)量安全及品質(zhì)改善提供數(shù)據(jù)，對(duì)修訂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)以及蔬菜的安全生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 生菜的培養(yǎng)及染毒

本研究選取玻璃生菜Lettuce（Iceberg L.）作為研究對(duì)象，采用蛭石將生菜種子培育至四葉一心后，移入水培盆中，每個(gè)水培盆種植生菜12株。各水培盆中均裝有5 L的Hoagland營養(yǎng)液，成分組成見表1。用NaOH調(diào)節(jié)pH為6.0，并及時(shí)補(bǔ)充蒸餾水至5 L水位線，定期用充氧泵進(jìn)行曝氣處理，定期測定培養(yǎng)液中砷含量的變化。

表1 Hoagland營養(yǎng)液的成分表Table 1 Formula of Hoagland nutrient solution

為考察不同砷酸鹽As（Ⅴ）初始添加濃度對(duì)生菜生長的影響，分別設(shè)置0.5、1、5、10、30 mg·L-1的砷酸鹽濃度（分別表示為V-0.5、V-1、V-5、V-10、V-30，V代表五價(jià)砷，由于V-30處理組在生菜生長至第10 d全部死亡，因此不再作分析），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（CK），以及不添加植物空白對(duì)照組（NP）。

為研究腐植酸對(duì)生菜砷脅迫的影響，選取V-10處理組，分別添加1、5、10 mg·L-1的腐植酸（分別表示為V10HA1、V10HA5、V10HA10，HA代表腐植酸），同時(shí)設(shè)置腐植酸的空白添加實(shí)驗(yàn)，在不添加砷的營養(yǎng)液中分別添加腐植酸5、10 mg·L-1（分別表示為CKHA5、CKHA10）。其中腐植酸分子式為 C9H9NO6，CAS：1415-93-6，黃腐酸（富里酸）含量≥90%。為考察不同生長期生菜生長表現(xiàn)，分別在生菜生長早期（生長至第10 d，Day10）、中期（生長至第20 d，快速生長期，Day20）、收獲期（生長至第30 d，生長趨于穩(wěn)定，Day30）時(shí)，隨機(jī)選取生菜樣品3株，采用便攜式葉綠素儀（SPAD-502，Minolta Camera，Osaka，Japan）對(duì)應(yīng)測定葉片的SPAD（Soil and plant analyzer develotrn?ent）值，每個(gè)處理組測定30次取平均值。采集生菜樣品，分別進(jìn)行植物鮮質(zhì)量、株高、根長的測定。

1.2 pH、砷總量及砷形態(tài)的測定方法

染毒前，統(tǒng)一調(diào)節(jié)各實(shí)驗(yàn)組中培養(yǎng)液pH為6.0。在生菜3個(gè)對(duì)應(yīng)生長期，進(jìn)行pH測定，并進(jìn)一步采集10 mL培養(yǎng)液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，測定培養(yǎng)液中的砷總量及形態(tài)。

在生菜不同生長期，從每個(gè)處理組中隨機(jī)采集生菜樣品3株，使用陶瓷剪刀將其剪碎并混勻。同時(shí)各植株分別稱取根、莖、葉樣品2 g，每個(gè)樣品制備兩份，其中一份用于生菜中砷形態(tài)的測定[13]，將樣品研磨后加入10 mL提取劑（磷酸緩沖鹽：2 mmol·L-1磷酸氫二銨和0.2 mmol· L-1EDTA），250 r·min-1振蕩20 min，8 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，上機(jī)測定。另外一份置于消解管中，加入10 mL濃硝酸過夜，置于電熱消解儀上進(jìn)行消解，升溫至120℃加熱0.5 h，后升溫至150℃繼續(xù)加熱3 h，再調(diào)至170℃趕酸至0.5 mL，待消煮管內(nèi)液體冷卻后定容至10 mL，上機(jī)測定。

溶液及生菜中砷形態(tài)的測定采用HPLC-ICP-MS（HPLC：Agilent1100；ICP-MS：Agilent Technologies 7700 Series），流動(dòng)相為 20 mmol·L-1檸檬酸+5 mmol·L-1己烷磺酸鈉，采用NaOH調(diào)節(jié)pH為4.3，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1 mL·min-1，測定過程中，通過添加質(zhì)控、監(jiān)控點(diǎn)以及復(fù)測方式進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 生菜品質(zhì)指標(biāo)測定方法

為研究不同處理組在生菜快速生長期營養(yǎng)品質(zhì)變化，采用維生素C、可溶性糖、硝酸鹽、總酚測定試劑盒進(jìn)行生菜品質(zhì)指標(biāo)的測定，試劑盒均由南京建成生物有限公司提供。氨基酸的測定采用Sykam S433D型氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行，氨基酸的提取采用王麗[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

除另有說明外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。采用SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，通過T檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為具有顯著差異。同時(shí)采用SIMCA 14.1軟件對(duì)氨基酸差異分布進(jìn)行PLS-DA分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理組培養(yǎng)液pH的變化

如圖1所示，NP組pH在各時(shí)期基本維持穩(wěn)定。當(dāng)移入生菜后，CK中培養(yǎng)液的pH呈上升趨勢(shì)，當(dāng)生長至第30 d時(shí)，溶液中的pH達(dá)到8.07，增加了34.1%。有研究指出，當(dāng)施用硝態(tài)氮肥時(shí)，植物根系吸收的氮素以硝態(tài)氮為主，植物根際會(huì)釋放OH-、HCO-3，導(dǎo)致根際環(huán)境pH升高[15]。當(dāng)外源As（Ⅴ）濃度在1 mg·L-1以上時(shí)，溶液的pH在不同生長時(shí)期均表現(xiàn)出明顯的下降，說明在As（Ⅴ）的脅迫下，生菜體內(nèi)產(chǎn)酸代謝能力增強(qiáng)，而當(dāng)溶液中As（Ⅴ）濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，溶液中pH在生菜的各生長期均下降至最低，在生菜生長至第10 d時(shí)達(dá)到3.87，然后隨著生菜的生長和適應(yīng)能力的增強(qiáng)，pH在生菜生長中、后期開始回升至5.60。有研究指出，在外界環(huán)境脅迫條件下，大部分植物會(huì)分泌有機(jī)酸，這被認(rèn)為是對(duì)不利條件的適應(yīng)[16]。當(dāng)As濃度達(dá)到30 mg·L-1時(shí)，生菜在染毒至第10 d出現(xiàn)了干枯死亡現(xiàn)象，溶液中pH與NP組一致，沒有明顯變化。

圖1 生菜培養(yǎng)液的pH變化Figure 1 The change of pH of culture solution of lettuce

同時(shí)，在生菜的空白溶液中添加腐植酸后，溶液的pH變化與不添加腐植酸的CK處理中pH變化趨勢(shì)基本相同，說明單純添加腐植酸并未引起溶液的pH發(fā)生顯著變化，而pH的升高是由生菜自身代謝作用引起的。由圖1可看出，在As（Ⅴ）濃度為10 mg·L-1的培養(yǎng)液中添加腐植酸，對(duì)生菜的砷毒性具有一定的緩解作用，但是在腐植酸添加量為1、5 mg·L-1時(shí)，作用并不明顯。當(dāng)腐植酸的添加量為10 mg·L-1時(shí)，生菜的產(chǎn)酸代謝得到緩解，溶液中的pH與單純添加10 mg·L-1的As（Ⅴ）相比，在生菜各個(gè)生長期均有明顯的升高，第10 d時(shí)pH回升最明顯，達(dá)到4.85。

2.2 不同處理組生菜葉中砷的累積變化規(guī)律

研究初始在培養(yǎng)液中添加不同濃度的As（Ⅴ），并在第10、第20、第30 d時(shí)對(duì)不同處理組的培養(yǎng)液進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)各處理組培養(yǎng)液中的砷主要以As（Ⅴ）存在，未檢測到有機(jī)砷和As（Ⅲ）。如圖2所示，砷的積累主要集中在生菜的根部[17]，其次為莖部，葉中含量最少。在As（Ⅴ）添加濃度為10 mg·L-1時(shí)，根中無機(jī)砷最高累積濃度達(dá)到328.07 mg·kg-1，不同砷酸鹽處理組，生菜各組織中無機(jī)砷的含量均隨著處理濃度的增加而在各生長時(shí)期呈現(xiàn)出不同的增加趨勢(shì)。砷酸鹽處理組，生菜體內(nèi)砷主要是以As（Ⅲ）形態(tài)存在。有研究指出，砷酸鹽As（Ⅴ）被植物根吸收后，會(huì)與富含硫醇的肽絡(luò)合，從而在植物體內(nèi)很容易還原成As（Ⅲ），As（Ⅲ）與含硫?；?SH）的化合物如植物螯合素（PC）配位，As-PC復(fù)合物被認(rèn)為會(huì)儲(chǔ)存在液泡中[18]，從而減少了砷對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及細(xì)胞器中各種生理代謝活動(dòng)的影響，達(dá)到植物解毒的作用。在CK及CKHA處理組中砷主要是以As（Ⅴ）形態(tài)存在于植物中。腐植酸富含含氧官能團(tuán)，可與As（Ⅴ）絡(luò)合增加其植物吸收能力。從植物根、莖、葉中砷含量的結(jié)果看，腐植酸的添加降低了根中砷的積累，促進(jìn)了砷向生菜莖和葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)。Park等[19]研究表明，添加腐植酸增加了植物葉中 Pb、Cu、Cd、Ni的積累；Xu等[20]的研究指出，腐植酸是通過增加植物細(xì)胞壁的延展性而刺激Pb2+的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累。這是因?yàn)楦菜崤c植物根部分泌的有機(jī)酸以及根際微生物活動(dòng)的相互作用會(huì)將腐植酸的超分子結(jié)構(gòu)分解為易被植物吸收的小分子單元，從而促進(jìn)植物對(duì)腐植酸-重金屬絡(luò)合物的吸收，增加了植物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。

如圖2A所示，在0.5 mg·L-1的As（Ⅴ）添加濃度條件下，生菜根部生長早、中期主要以As（Ⅴ）吸附積累為主，到生長后期，隨著植物體內(nèi)砷的積累，逐漸被轉(zhuǎn)化為As（Ⅲ）。生菜根部無機(jī)砷含量隨著砷酸鹽添加濃度的升高逐漸增加，當(dāng)As（Ⅴ）濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，生菜生長早期根部無機(jī)砷含量最高可達(dá)328.07 mg·kg-1，As（Ⅴ）濃度從 0.5 mg·L-1增長到 10 mg·L-1時(shí)，生菜根中砷的含量由隨時(shí)間增加逐漸變?yōu)殡S時(shí)間而減少。有研究指出當(dāng)植物受砷脅迫較嚴(yán)重時(shí)，根部的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將砷排出到外部介質(zhì)中，增強(qiáng)植物根際As（Ⅲ）的外排能力[22]。在添加腐植酸處理組中，當(dāng)腐植酸的濃度為1、5 mg·L-1時(shí)，相比V-10處理組，無機(jī)砷的含量在生菜各生長期整體呈下降趨勢(shì)，但是進(jìn)一步提高腐植酸的添加濃度（10 mg·L-1），對(duì)根部無機(jī)砷的積累不但沒有降低作用，反而有明顯的回升趨勢(shì)，所以，適量的腐植酸添加可以降低根部無機(jī)砷的積累。

如圖2B所示，生菜莖部無機(jī)砷含量隨著砷酸鹽添加濃度的升高逐漸增加，但對(duì)于相同砷酸鹽處理組，無機(jī)砷的積累均隨著生菜生長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。在添加腐植酸處理組中，隨著腐植酸添加濃度的增加，莖部無機(jī)砷含量在生菜各生長期均逐漸下降，在生菜生長早期，無機(jī)砷含量明顯高于未添加腐植酸組，由此推斷腐植酸的添加促進(jìn)了莖部早期無機(jī)砷的積累，并呈現(xiàn)濃度依賴性，而隨著生菜生長至中、后期，腐植酸的作用逐漸消失，各腐植酸處理組與未添加組無機(jī)砷含量基本保持一致。

圖2 生菜各組織中砷形態(tài)的變化Figure 2 The changes of arsenic species in the lettuce tissues

如圖2C所示，生菜葉部無機(jī)砷含量隨著砷酸鹽添加濃度的升高逐漸增加，當(dāng)As（Ⅴ）濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，生菜生長早期葉部無機(jī)砷積累濃度最高可達(dá)0.68 mg·kg-1。與莖部變化趨勢(shì)相反，對(duì)于相同砷酸鹽處理組，無機(jī)砷的積累均隨著生菜生長呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，推斷主要與莖部的無機(jī)砷向葉部轉(zhuǎn)移有關(guān)。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[23]，由圖2C可知，當(dāng)As（Ⅴ）添加濃度為3.5 mg·L-1時(shí)，生菜生長晚期葉部的無機(jī)砷含量已超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)。與莖部一致，腐植酸的添加，在生長早期均不同程度地促進(jìn)了無機(jī)砷的葉部積累，最高積累量也是在腐植酸添加濃度為1 mg·L-1時(shí)，達(dá)到1.32 mg·kg-1，是未添加腐植酸組的1.94倍，而在生菜生長中期，腐植酸的添加均不同程度地降低了無機(jī)砷的積累。當(dāng)腐植酸添加濃度為5 mg·L-1時(shí)，生菜葉部無機(jī)砷積累量最低為0.49 mg·kg-1，相比未添加腐植酸組降低了33.78%。但生菜生長后期，腐植酸降低葉部無機(jī)砷含量的作用消失，無機(jī)砷的積累相比生長中期隨著腐植酸添加濃度的增加產(chǎn)生明顯的增加趨勢(shì)，最高達(dá)到1.60 mg·kg-1。由此推斷，低于5 mg·L-1的適量腐植酸添加在生菜生長中期具有明顯降低生菜葉部無機(jī)砷積累的作用，均能使生菜早期葉部無機(jī)砷含量降至限量標(biāo)準(zhǔn)附近，但是隨著生菜的生長，腐植酸的作用消失，并隨著腐植酸的過量添加，呈現(xiàn)明顯的無機(jī)砷吸收積累增加趨勢(shì)，腐植酸的無機(jī)砷去除作用具有時(shí)間和濃度依賴性。

2.3 不同處理組生菜生長表現(xiàn)

圖3 不同處理組生菜的生物量、株高、根長和葉綠素的變化Figure 3 The fresh weight，plant height，root length and chlorophyll change of lettuce in different treatment groups

如圖3A所示，各處理組生菜鮮質(zhì)量隨生菜生長逐漸升高，不同處理組生菜的鮮質(zhì)量隨As（Ⅴ）添加濃度的升高而呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)As（Ⅴ）濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，生菜生長至第10、20、30 d時(shí)的生物量較CK組分別下降了56.22%、68.66%、77.30%。CKHA與CK組的生物量并無顯著差異，而在10 mg·L-1As（Ⅴ）處理組，生菜生物量隨著腐植酸濃度的升高而升高，當(dāng)腐植酸添加濃度為10 mg·L-1時(shí)，生菜生物量達(dá)到最大49.77 g，相比V-10增加了227.43%。說明腐植酸具有明顯促進(jìn)生菜生物量增加的作用，這與之前的研究報(bào)道一致[11-12]。

如圖3B和圖3C所示，生菜株高、根長的變化與生物量變化趨勢(shì)基本一致，相同處理組生菜株高與根長均隨生菜生長逐漸增加，不同處理組生菜株高、根長與As（Ⅴ）濃度呈負(fù)相關(guān)，V-10處理組生菜的株高、根長均達(dá)到最低，生菜生長至第30 d時(shí)，株高較CK組下降了11.50%，根長較CK組下降了47.62%。CKHA與CK組的株高并無顯著差異，在10 mg·L-1As（Ⅴ）處理組，腐植酸的添加對(duì)生菜株高并無顯著作用，而對(duì)生菜根的生長具有不同程度的輕微促進(jìn)作用。

如圖3D所示，相比CK，各處理組生菜生長早期隨著As（Ⅴ）濃度的增加葉綠素呈遞增趨勢(shì)，而在生長后期葉綠素含量呈遞減趨勢(shì)，造成不同程度的葉綠體損傷。當(dāng)As（Ⅴ）濃度提高到10 mg·L-1時(shí)，在第30 d時(shí)，葉綠素含量降至最低為19.75，相比CK下降了17.98%。相比CK，單純的腐植酸添加并未顯著引起生菜葉綠素變化。對(duì)于砷酸鹽處理組，適當(dāng)濃度的腐植酸添加在生菜各生長期均不同程度地增加了生菜的葉綠素含量，當(dāng)腐植酸濃度為5 mg·L-1時(shí)，生菜生長至第10、20、30 d時(shí)，葉綠素含量分別提高了10.71%、11.18%、18.41%。而進(jìn)一步提高腐植酸濃度到10 mg·L-1時(shí)，葉綠素含量較腐植酸濃度為5 mg·L-1時(shí)整體呈現(xiàn)不同程度的下降，說明適當(dāng)濃度的腐植酸對(duì)降低砷酸鹽的葉綠體損傷具有緩解作用。姜佰文等[24]研究指出，適量的腐植酸添加會(huì)促進(jìn)葉綠素合成，與本文結(jié)論一致。

綜上，當(dāng)As（Ⅴ）添加濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生物量、株高、根長以及葉綠素的相對(duì)含量均高于CK組，說明低濃度的砷酸鹽可促進(jìn)生菜生長，具有低劑量興奮作用[25-26]，高濃度砷酸鹽均不同程度地對(duì)生菜生長產(chǎn)生抑制作用[17]，其中地上部的生長會(huì)比根的生長受到更大的影響[27]。已有報(bào)道腐植酸對(duì)植物生長以及根系發(fā)育具有積極作用[28]，從本文研究結(jié)果可看出，腐植酸對(duì)高濃度砷酸鹽的生菜毒性作用有所緩解。

2.4 不同處理組生菜品質(zhì)指標(biāo)的變化

2.4.1 基本營養(yǎng)指標(biāo)的變化

由圖4A可知，當(dāng)添加不同濃度的As（Ⅴ）時(shí)，生菜葉中維生素C的含量均高于CK組，其中As（Ⅴ）添加濃度為0.5 mg·kg-1時(shí)，生菜葉中維生素C的含量較CK提高了65.38%。在CK處理中添加腐植酸，生菜維生素C的含量無明顯變化，而在砷酸鹽處理組添加腐植酸可顯著提高生菜中維生素C的含量。當(dāng)腐植酸添加濃度為5 mg·L-1時(shí)，維生素C含量達(dá)到最大，較V-10處理增加了92.27%。有研究報(bào)道，維生素C與植物抗逆能力呈正相關(guān)，不超標(biāo)情況下，添加適量砷可提高生菜中維生素C含量，腐植酸促進(jìn)維生素的積累可能與光合作用水平提高有關(guān)，并且過量的腐植酸添加會(huì)引起葉綠體損傷[29]，這與本文研究結(jié)果一致。

如圖4B所示，不同濃度砷酸鹽處理組，生菜的總酚含量無顯著差異。而在10 mg·L-1As（Ⅴ）的培養(yǎng)液中添加腐植酸時(shí)，生菜中總酚的含量隨著腐植酸添加濃度的升高呈先升高后降低，當(dāng)腐植酸濃度為5 mg·L-1時(shí)，相比V-10處理組總酚含量增加了21.83%，與前述營養(yǎng)指標(biāo)類似，進(jìn)一步提高腐植酸濃度到10 mg·kg-1時(shí)，總酚的含量下降。

圖4 不同處理組生菜的維生素C、總酚、可溶性糖、硝酸鹽含量的變化Figure 4 The changes in the content of vitamin C，total phenol，soluble sugar，and nitrate of lettuce in different treatment groups

如圖4C所示，生菜中可溶性糖含量隨著砷酸鹽濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在添加0.5 mg·L-1As（Ⅴ）后，生菜的可溶性糖含量顯著升高，相較CK組升高了61.62%，而As（Ⅴ）濃度高于0.5 mg·L-1時(shí)，生菜的可溶性糖含量相較CK處理組下降，當(dāng)As（Ⅴ）濃度為10 mg·L-1時(shí)，生菜可溶性糖下降了18.67%。在砷酸鹽處理組添加腐植酸會(huì)使生菜中可溶性糖含量下降，在加入10 mg·L-1的腐植酸后，與V-10處理組相比，可溶性糖含量下降了22.30%。劉華琳[30]的研究指出，砷毒害使植物還原糖、非還原糖、可溶性總糖含量增加，α-淀粉酶、β-淀粉酶、蔗糖磷酸化酶活性下降，蔗糖合成酶、酸性轉(zhuǎn)化酶、淀粉磷酸化酶活性升高，進(jìn)而導(dǎo)致水稻幼苗碳代謝紊亂。

如圖4D所示，隨著外源砷酸鹽添加濃度的升高，生菜所含硝酸鹽的含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)As（Ⅴ）添加濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生菜中硝酸鹽含量最低為216.89 mg·kg-1，相比CK處理組下降了53.73%，隨著砷酸鹽濃度進(jìn)一步提高，生菜中硝酸鹽的含量顯著升高，在10 mg·L-1處理組，生菜中的硝酸鹽含量較CK組升高了391.83%。Mao等[31]研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物響應(yīng)重金屬脅迫中具有重要作用，植物吸收NO-3可提高對(duì)重金屬的耐受性。所以重金屬脅迫會(huì)促進(jìn)植物對(duì)硝酸鹽的吸收。從添加腐植酸的結(jié)果看，相比CK，添加腐植酸對(duì)生菜中硝酸鹽的含量沒有顯著影響，在含As（Ⅴ）的培養(yǎng)液中添加腐植酸時(shí)，生菜中硝酸鹽隨著腐植酸添加濃度的增加呈顯著下降趨勢(shì)，當(dāng)腐植酸的添加濃度為5 mg·L-1時(shí)，生菜中的硝酸鹽含量最低為775.42 mg·kg-1，較V-10處理組降低了66.37%，進(jìn)一步提高腐植酸添加量，生菜中硝酸鹽的含量具有回升趨勢(shì)，說明適量的腐植酸添加，可以顯著降低生菜中硝酸鹽的含量。

維生素C是一種還原劑，可使SOD酶活性增強(qiáng)，從而提高機(jī)體免疫力，對(duì)人類防癌和抗衰老有重要作用[32]?？扇苄蕴强梢跃S持植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，而攝入硝酸鹽含量較高的蔬菜會(huì)增加人體患腸胃癌等疾病的幾率[33]。從本文的結(jié)果看，V-0.5處理組的維生素C和可溶性糖含量最高，硝酸鹽含量最低?？梢姡谏巳~內(nèi)砷含量不超標(biāo)的條件下，外源砷濃度為0.5 mg·L-1會(huì)提高生菜的品質(zhì)。腐植酸可促進(jìn)根系生長，提高根系活力，同時(shí)促進(jìn)植物的光合作用，以此增強(qiáng)作物抗逆性，提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量。在高濃度砷處理組中，V10HA5處理組的維生素C含量最高，硝酸鹽含量最低，說明添加適量腐植酸可以提高生菜的品質(zhì)，過量的腐植酸不僅造成資源浪費(fèi)，對(duì)蔬菜品質(zhì)的改善效果也會(huì)降低。

2.4.2 游離氨基酸的變化

圖5A為根據(jù)砷處理組與CK組生菜氨基酸含量做PLS-DA分析得到的VIP圖。由圖可看出，應(yīng)對(duì)砷酸鹽脅迫的主要差異表達(dá)氨基酸類型為谷氨酸（GLU）和精氨酸（ARG），其中不同砷處理組生菜ARG表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，V-10處理組相比CK組，GLU表達(dá)水平下降了19.69%，ARG表達(dá)水平下降了90.31%。

圖5B主要表示腐植酸對(duì)生菜中氨基酸表達(dá)水平的影響，結(jié)合PLS-DA分析及VIP得分可知，GLU和ARG同時(shí)也是腐植酸添加后所引起的主要差異表達(dá)氨基酸類型。其中腐植酸上調(diào)了GLU的表達(dá)水平，與CK組相比，CKHA5處理組GLU的表達(dá)水平提高了34.71%，與V-10處理組相比，V10HA1處理組GLU的表達(dá)水平提高了44.55%；同時(shí)腐植酸的添加也引起了ARG表達(dá)水平的提高，與CK組相比，CKHA5的ARG表達(dá)水平升高了62.84%，與V-10處理組相比，V10HA1的ARG表達(dá)水平升高了801.26%。

在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，GLU在△1-吡咯琳-5羧酸合成酶（P5CS）和△1-吡咯琳-5羧酸還原酶（P5CR）的作用下合成脯氨酸，脯氨酸在植物細(xì)胞中起著重要作用，可以作為滲透劑、羥自由基清除劑，還可以作保護(hù)酶的相溶性溶質(zhì)[34]。植物體內(nèi)的P5CS通常有兩個(gè)同源的P5CS基因編碼，這兩個(gè)同源的P5CS在不同脅迫條件下的表達(dá)水平存在差異[35]。砷脅迫下，植物中脯氨酸的含量通常會(huì)增加[36]，則作為底物的GLU降低，這與本文結(jié)果相符。而在腐植酸處理組中，腐植酸的添加增加了植物中GLU的含量，表明腐植酸在一定程度上降低了植物的脅迫。從本研究也可看出，ARG在砷脅迫下受到顯著影響。ARG是抗氧化性氨基酸，具有良好的清除自由基能力[37]，是生成多胺、一氧化氮和GLU等的前體物質(zhì)，而多胺、一氧化氮是植物體內(nèi)重要的信使分子，參與生長發(fā)育、抗逆等幾乎所有的生理生化過程[38]。Capone等[39]的研究表明，ARG代謝有利于植物對(duì)逆境的感知和識(shí)別。砷脅迫下，ARG含量不同程度降低，表明ARG可能生成了許多作為信使分子的多胺和一氧化氮。而腐植酸的添加在一定程度增加了ARG的含量，降低了植物的砷脅迫。

圖5 砷處理組與腐植酸處理組生菜氨基酸含量水平（A、B）和VIP圖（C、D）Figure 5 The relative level（A and B）and the VIPdiagramanalysis（Cand D）of amino acid content in lettuce after arsenate stressand humic acid is added to the medium

3 結(jié)論

（1）隨著砷酸鹽添加濃度的增加，生菜產(chǎn)酸代謝增強(qiáng)，添加腐植酸能夠明顯緩解生菜的產(chǎn)酸脅迫作用。

（2）當(dāng)砷酸鹽添加濃度低于3.5 mg·L-1時(shí)，在生菜各生長時(shí)期，可食部分葉中的砷含量均不超國家限量標(biāo)準(zhǔn)。腐植酸在生菜生長初期會(huì)促進(jìn)砷在莖和葉中的積累，中期會(huì)顯著降低葉中砷的含量，后期會(huì)增加葉中砷的積累。

（3）當(dāng)砷酸鹽添加濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，可促進(jìn)生菜的生長，同時(shí)會(huì)增加生菜葉中的葉綠素含量。而添加腐植酸可以顯著改善由于高濃度砷脅迫導(dǎo)致的生菜生長抑制作用。

（4）腐植酸可上調(diào)由于砷脅迫而降低的與抗逆相關(guān)的GLU和ARG含量，適量的腐植酸添加可顯著改善生菜的營養(yǎng)品質(zhì)，在砷酸鹽處理組，5 mg·L-1的腐植酸添加對(duì)改善生菜營養(yǎng)品質(zhì)具有較好的效果。