(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系,河南漯河 462006)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為女性健康的最大威脅。常規(guī)化療藥物的毒副作用和多藥耐藥性是成為化療失敗的主要原因。中草藥提取物在治療肺癌及減毒增效方面發(fā)展迅速，在治療肺癌方面有著巨大潛力。葫蘆巴為豆科葫蘆巴屬植物，是世界上最早的藥用植物之一。目前對(duì)葫蘆巴的研究已經(jīng)表明其具有抗氧化[1]、抗糖尿病[2]、降膽固醇[3]、抗生育[4]、抗免疫、抗腫瘤[5]等作用。本實(shí)驗(yàn)報(bào)道葫蘆巴種子醇提取物對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購(gòu)于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）購(gòu)買于國(guó)藥控股漯河有限公司，經(jīng)鑒定為豆科植物蒙古葫蘆巴的干燥根。MTT、碧云天TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于鄭州天馳生物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備

取干燥的葫蘆巴藥材100g，粉碎至適宜粒度，用1000mL75%乙醇滲漉提取，提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，加水分散至100mL制成水混懸液。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有機(jī)層，得到4個(gè)部分：Ⅰ（石油醚層）、Ⅱ（乙酸乙酯層）、Ⅲ（正丁醇層）、Ⅳ（水層部分）。將提取的各個(gè)部分分別減壓回收溶劑至干，加適量95%乙醇溶解，再加蒸餾水稀釋(乙醇終濃度≤1.5%）制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的混懸液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將乳腺癌MCF-7細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中（CO2濃度：5%，T：37℃），用RMPI 1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%雙抗）培養(yǎng)，每天換液一次，換液前觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，平均2天傳代一次（觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80%-90%左右即可傳代）。傳代方法：除去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2-3遍后加入0.25%胰蛋白酶0.8ml，消化3-4分鐘，待消化完全后（細(xì)胞間隙變大，形狀變圓即為消化完全），立即加入RMPI164培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞使其充分脫落后分裝，放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 MTT檢測(cè)法

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞培養(yǎng)版96孔板每孔加入100ul，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至10000孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充；5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物；5%CO2，37℃孵育48小時(shí)；每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-對(duì)照孔A值)／對(duì)照孔A值]×100%。

2.4 TUNEL實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板每孔加入2ml，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1.6×106/孔。5%CO2，37℃孵育，待細(xì)胞貼壁。加入正丁醇層萃取物，孵育48H。PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛固定60分鐘；PBS洗滌1次，加入免疫染色洗滌液，冰浴孵育2分鐘，再用甲醇配制的0.3%過(guò)氧化氫溶液中室溫孵育20分鐘，PBS洗滌1次；配制生物素標(biāo)記液，在樣品上加50μl生物素標(biāo)記液，37℃孵育60分鐘，PBS洗滌1次，滴加0.1-0.3ml標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10分鐘。顯色，熒光顯微鏡下觀測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)200個(gè)細(xì)胞來(lái)判斷細(xì)胞凋亡情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測(cè)葫蘆巴提取物對(duì)MCF-7的抑制作用

利用MTT法檢測(cè)葫蘆巴醇提物各層萃取物高（100μg/ml）、中（10μg/ml）、低（1μg/ml）三個(gè)濃度分別對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用。各層萃取物低中濃度對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用較弱，高濃度萃取物對(duì)MCF-7有一定的抑制作用，其中正丁醇層萃取物抑制作用最強(qiáng)。

結(jié)果如表1所示。

表1 葫蘆巴提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

3.2 MTT法檢測(cè)正丁醇層萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

利用MTT法檢測(cè)正丁醇層萃取物1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的抑制率。正丁醇萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用呈劑量依賴性，利用SPSS17.0計(jì)算得出IC50為81.30μg/ml，結(jié)果如圖1所示。

3.3 TUNEL法檢測(cè)正丁醇萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

利用TUNEL法檢測(cè)正丁醇萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入正丁醇層萃取物，終濃度為81.30μg/ml，孵育48h。與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組凋亡率增加64.12%，結(jié)果如圖2、3所示。

4 討論

本研究利用MTT實(shí)驗(yàn)及TUNEL實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了葫蘆巴種子醇提物正丁醇層萃取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制及凋亡的影響。Mai等人研究證明葫蘆巴種子油對(duì)Vero、WISH、MCF-7、HEp2四種細(xì)胞均有抑制作用，其中對(duì)MCF-7和HEp2兩種細(xì)胞的作用最強(qiáng)[6]。Amr等人研究證明葫蘆巴提取物對(duì)有DMBA誘導(dǎo)Wistar大鼠乳腺癌腫瘤有抑制作用[7]。我們首先利用MTT檢測(cè)了葫蘆巴種子醇提物各層萃取物作用48h對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用，高濃度的各層萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞均有抑制作用，其中正丁醇萃取物的抑制作用最強(qiáng)。然后我們又單獨(dú)檢測(cè)了正丁醇萃取物對(duì)MCF-7的作用，結(jié)果顯示正丁醇萃取物對(duì)MCF-7的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。為進(jìn)一步驗(yàn)證正丁醇萃取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用是由提取物誘導(dǎo)所引起的，我們又利用TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在正丁醇萃取物IC50（81.30μg/ml）作用48h后的凋亡作用，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組凋亡率比對(duì)照組增加64.12%，驗(yàn)證了正丁醇萃取物能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。Rahmati等人研究證明，從葫蘆巴種子提取出的薯蕷皂苷元對(duì)肺癌細(xì)胞A549有抑制作用[8]。另有文獻(xiàn)報(bào)道葫蘆巴種子所含的番木瓜堿對(duì)淋巴樣白血病有顯著的活性，對(duì)小鼠肝癌(HAc)有明顯的抑制作用[9]。葫蘆巴提取物不同成分對(duì)癌細(xì)胞的作用不同，因此我們將進(jìn)一步探索葫蘆巴種子提取物對(duì)乳腺癌作用的具體成分。

綜上所述，葫蘆巴種子醇提物正丁醇萃取物誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。