姜自紅

(滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)院， 安徽 滁州 239000)

0 引言

野菊花和菊花(茶用菊品種)均為菊科菊屬多年生草本植物，黃酮類化合物、綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡?；鼘幩釣榫栈ㄓ行С煞諿1-4]. 現(xiàn)代研究表明，菊花中的這些成分具有抗氧化、抗癌和治療心血管病的功能[5-9]. 我國菊屬植物種質(zhì)資源豐富，菊花品種多，野菊種類多[10]. 目前國內(nèi)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道菊花或野菊中總黃酮含量和綠原酸等有機(jī)酸類的提取方法和含量[11-15]，但沒有將茶用菊花和野菊的這些成分的含量進(jìn)行綜合比較. 本研究比較了茶用菊花和野菊不同植物花序有效成分含量差異，為菊花品種改良和野菊資源的開發(fā)利用提供了參考.

1 原料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗(yàn)材料：5種茶用菊，即大白菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Dabaiju’)、亳菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Bozhou’)、滁菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Chuju’)、黃山貢菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Gongju’)、金絲皇菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Jinsihuangju’)；5種野菊，即薩摩野菊(D.ornatum)、野路菊(D.japonense)、乙立寒菊(D.indicumvar.maruyamanum)、陰岐油菊(D.okiense)、紫花野菊(D.zawadskii(Herb.) Tzvel). 本試驗(yàn)所用材料均取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)瑣石村菊花實(shí)驗(yàn)基地，為基地種質(zhì)資源圃對應(yīng)種(品種).

主要試劑：亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等(分析純)購自南京化學(xué)試劑有限公司，甲醇、乙腈(色譜純)購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，盧丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所，標(biāo)樣樣品為上海源葉生物科技有限公司HPLC提供.

主要儀器：LC-1260高效液相色譜(安捷倫)、Cytation3細(xì)胞成像多功能檢測儀(BioTek)、VGT-2013QTD型號超聲波水浴鍋(昆山市超聲儀器有限公司)、Scientz-48組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司).

1.2 材料處理方法

于2017年秋季選取開放程度達(dá)到70%左右的菊花，確?；ǘ浯笮?、質(zhì)量相近. 用清水沖洗，晾干后置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，取適量干花樣品，剪碎后統(tǒng)一置于5 mL離心管中并加入小鋼珠2粒，使用液氮冷凍后立即使用Scientz-48組織研磨器粉碎20 s，至材料變?yōu)榧?xì)膩的粉末.

1.3 總黃酮的含量測定方法

總黃酮的含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定[16].

1.3.1 供試品溶液的制備

取干花粉0.1 g共3份，加70%的乙醇9 mL為溶劑. 于60 ℃超聲恒溫水浴鍋中浸提30 min，以4 000 r/min離心10 min后取上清液，重復(fù)提取2次，合并后定容至25 mL，為供試溶液.

1.3.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品于80 ℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定，取5.5 mg的樣品以70%乙醇溶液為溶劑，待完全溶解后定容至10 mL，此為對照品溶液.

1.3.3 線性關(guān)系

分別精確吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL的對照品溶液至6支不同試管中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]，反應(yīng)后用70%乙醇溶液補(bǔ)足至10 mL. 待溶液顯色后以蘆丁空白為對照，置于酶標(biāo)儀中于510 nm 波長處進(jìn)行比色測定其吸光度，并求出回歸方程.

1.3.4 樣品含量的測定

分別精確吸取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL離心管中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]，反應(yīng)后用70%乙醇溶液補(bǔ)足至10 mL. 顯色后于波長510 nm進(jìn)行測定，用酶標(biāo)儀測出各樣品的OD值，利用回歸方程和公式計(jì)算出各個(gè)樣品的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù).

樣品總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)=(C×V2×V0)/(V1×M).

式中：C為質(zhì)量濃度，M為樣品初始質(zhì)量，V0為供試液的體積，V2為最終稀釋的體積，V1為1 mL.

1.4 綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮繙y定方法

參考2015年版《中華人民共和國藥典》對菊花中的綠原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷康臏y定方法，選用高效液相色譜法(UPLC)進(jìn)行測定[17].

1.4.1 供試品溶液的制備

取3份干花粉末各0.25 g，加入70%的甲醇9 mL為溶劑，于60 ℃超聲水浴鍋中恒溫浸提30 min，以4 000 r/min離心10 min取上清液. 重復(fù)提取2次，合并上清液定容至25 mL. 搖勻并靜置后使用微孔濾膜(0.22 μm，有機(jī)相)過濾，備用.

1.4.2 對照液的制備

取綠原酸樣品360 μg、木犀草苷樣品270 μg及3,5-O-二咖啡?；鼘幩針悠?50 μg，加入70%的甲醇溶解并定容至10 mL. 取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品混合液，加70%甲醇定容至10 mL，于4 ℃冰箱中保存.

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫：柱溫為30 ℃，流速為0.4 mL/min，檢測波長348 mn，樣品進(jìn)樣量為5 μL. 理論板數(shù)按3,5-O-二咖啡?；鼘幩岱逵?jì)算應(yīng)不低于8 000.

1.4.4 線性關(guān)系

取各濃度的對照溶液，置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量為5 μL，按照1.4.3的色譜條件進(jìn)行測定.以對照品進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸.

1.4.5 樣品含量的測定

取適量供試液樣品，進(jìn)樣量為5 μL，按照1.4.3的色譜條件進(jìn)行測定.

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=(C×V0)/M.

式中：C為質(zhì)量濃度，M為樣品初始質(zhì)量，V0為最終稀釋的體積.

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan的新復(fù)極差法檢測差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量

表2 10種菊屬植物總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：樣品間做差異顯著性分析，表中數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示處理間差異達(dá)0.01和0.05顯著水平(Duncan新復(fù)極差法).

以蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到

y=0.009 7x+0.016 7，R2= 0.999，n=3.

測得10種菊屬植物花序總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表2，10種菊屬植物的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8.3～29.7 mg/g之間，多數(shù)樣品總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10～20 mg/g之間，但差異不顯著. 野菊品種中紫花野菊、野路菊的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29.7 mg/g和24.6 mg/g，顯著高于多個(gè)茶用菊品種. 10種菊屬植物的總黃酮含量順序?yàn)椋鹤匣ㄒ熬?野路菊>大白菊>黃山貢菊>薩摩野菊>陰岐油菊>滁菊>金絲皇菊>亳菊>乙立寒菊.

2.2 綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮?/h3>

對照品(A)與樣品(B)的HPLC圖譜見圖1.綠原酸回歸方程為y=789.48x-0.208，R2=0.999 6，n=3，綠原酸濃度在3.6～72 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；木犀草苷回歸方程為y=1 865.9x-0.592 6，R2=0.999 6，n=3，木犀草苷濃度在6.5～130 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；3,5-O-二咖啡?；鼘幩峄貧w方程為y=642.99x-0.536 1，R2=0.999 6，n=3，3,5-O-二咖啡?；鼘幩釢舛仍?.7～54 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5A.對照品B.樣品

1.綠原酸； 2.木犀草苷； 3. 3,5-O-二咖啡?；鼘幩?/p>

圖1 對照品與樣品的HPLC圖譜

測得10種菊屬植物綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表3. 結(jié)果顯示：多個(gè)樣品中可檢測出3個(gè)活性成分，但陰岐油菊材料未檢測出綠原酸含量，可能是該品種綠原酸含量較低.

表3 10種菊屬植物綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：樣品間做差異顯著性分析，表中數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示處理間差異達(dá)0.01和0.05顯著水平(Duncan新復(fù)極差法).

10種菊屬植物的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.34%～1.93%之間，除陰岐油菊外，均高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.2%的要求. 不同菊屬植物的綠原酸含量差異顯著，其中乙立寒菊的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.93%，顯著高于其他材料，不同野菊種間綠原酸含量差異顯著. 茶用菊品種中黃山貢菊的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.65%，各茶用菊品種綠原酸含量存在差異. 各材料綠原酸含量順序?yàn)橐伊⒑?紫花野菊>野路菊>黃山貢菊>金絲皇菊>大白菊>亳菊>滁菊>薩摩野菊>陰岐油菊.

10種菊屬植物的木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.53%～2.33%之間，均遠(yuǎn)高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.08%的要求. 各材料的木犀草苷含量差異顯著，其中野路菊質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)1.33%；茶用菊品種中滁菊質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為1.29%. 各材料的木犀草苷含量順序?yàn)橐奥肪?滁菊>大白菊>黃山貢菊>薩摩野菊>紫花野菊>亳菊>金絲皇菊>陰岐油菊>乙立寒菊.

10種菊屬植物的3,5-O-二咖啡?；鼘幩豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.38%～3.50%之間，其中7種材料的3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷扛哂凇吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的最低要求. 不同菊屬植物間3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷坎町愶@著，其中乙立寒菊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為3.5%；茶用菊品種中黃山貢菊質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為2.29%. 各材料的3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷宽樞?yàn)橐伊⒑?黃山貢菊>野路菊>紫花野菊>金絲皇菊>滁菊>>薩摩野菊>大白菊>亳菊>陰岐油菊.

圖2 10種菊屬植物花序有效成分含量聚類分析

2.3 聚類分析

根據(jù)4個(gè)有效成分的分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 20.0軟件對10種菊屬植物進(jìn)行了Q型聚類分析，詳見圖2. 根據(jù)圖2結(jié)果可知，菊屬植物在閾值為25時(shí)分為兩大類，即野路菊、紫花野菊為一類，其他菊屬植物為一類. 當(dāng)閾值為5時(shí)，菊屬植物被分為4小類，即亳菊、金絲皇菊、滁菊、薩摩野菊、陰岐油菊為一類，大白菊與黃山貢菊為一類，乙立寒菊為一類，野路菊與紫花野菊為一類. 結(jié)果表明，多種菊屬植物的花序有效成分具有一定的相似性.

3 討論

除陰岐油菊材料未檢測到綠原酸外，各試驗(yàn)樣品中基本可檢測到4種活性物質(zhì)的存在，且測得的綠原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮烤哂?015 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的相關(guān)含量標(biāo)準(zhǔn). 所測菊屬植物材料的活性物質(zhì)含量差異顯著，其中紫花野菊總黃酮含量最高，乙立寒菊的綠原酸含量最高，野路菊的木犀草苷含量最高，乙立寒菊的3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量最高，說明多種野菊材料的一個(gè)或多個(gè)活性物質(zhì)含量高于茶用菊品種.

部分野菊與多種茶用菊花序有效成分含量上具有相似性，有入藥潛質(zhì)，或可作為茶用菊的遠(yuǎn)緣雜交材料，用于豐富現(xiàn)有茶用菊種質(zhì)資源，選育具有較高活性成分含量或優(yōu)良性狀的菊花品種.