林莉莉，魯 汭，龍憶年，陳宇華，肖恩榮，吳振斌

1.武漢理工大學資源與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430070 2.中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)和生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072 3.中國科學院大學，北京 100049

EPS (extracellular polymeric substances，胞外聚合物)是在一定環(huán)境條件下由微生物分泌于體外、相互粘附的有機高分子聚合物[1]，是微生物聚集體的主要成分. EPS過量積累是導致人工濕地(constructed wetland，CW)生物堵塞的重要因素，基質(zhì)中的堵塞物質(zhì)主要由厭氧分解產(chǎn)物〔如多糖類物質(zhì)、聚脲類物質(zhì)(EPS中蛋白質(zhì)類成分)〕以及受低溫及其他條件限制未能降解的有機化合物組成[2]. 相較于EPS的含量，EPS的成分和性質(zhì)對生物堵塞的形成具有更大影響[3]. 研究[4-5]表明，多糖的大尺寸和凝膠化行為以及低生物降解率可能導致基質(zhì)中多糖的更高積累潛力. TB-EPS (tightly bound EPS，緊密結合EPS)中含有較多的蛋白質(zhì)，而LB-EPS (loosely bound EPS，松散結合EPS)中的多糖含量較高，因此，與TB-EPS相比，LB-EPS與生物堵塞的相關性更為顯著[3,6]. 目前廣泛研究的人工濕地生物堵塞防治技術主要包括停床輪休[7-8]、原位化學解堵(化學溶脫劑[9-10]和鼠李糖脂[11])、原位生物解堵(細菌[12]、蚯蚓[13]及酶處理[14])等.

MFC (microbial fuel cells，微生物燃料電池)是一種以微生物作為催化劑氧化有機和無機物質(zhì)并同步產(chǎn)電的新型產(chǎn)能及廢水凈化技術[15]，對進水要求不高，幾乎所有有機物都可作為反應底物. MFC內(nèi)的產(chǎn)電菌可將EPS中難降解的大分子量的有機物分解成簡單的、可溶性的有機物加以利用并產(chǎn)生電能[16]. 大量研究[17-23]表明，MFC產(chǎn)生的微弱電場可以降低EPS含量并改變EPS中有機物的組成，有效控制膜污染. MFC形成的微弱電場對控制LB-EPS中多糖類小分子污染物具有明顯優(yōu)勢[22]. 因此，針對人工濕地生物堵塞對濕地壽命和運行效率影響深遠的問題，該試驗構建了雙室MFC系統(tǒng)用于處理EPS主要組分和人工濕地生物堵塞物，分析經(jīng)MFC處理前后EPS主要組分的含量變化，探究MFC緩解人工濕地生物堵塞的潛力，以期為人工濕地生物堵塞防治提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 雙室MFC反應器的構建與啟動

圖1 MFC裝置Fig.1 Schematic representation of the two-chambered MFC

試驗采用雙室MFC(見圖1)，陰、陽極室均為訂制的玻璃瓶(有效容積為300 mL)，呈“H”形狀連接，之間通過Nafion117質(zhì)子交換膜(proton exchange membrane，PEM)分隔. 采用石墨氈作為電極材料，陽極有效面積為80 cm2，陰極有效面積為32.5 cm2，石墨氈使用前經(jīng)1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl各處理2 h，并用蒸餾水清洗至pH為7以去除雜質(zhì). 陰、陽極之間通過鈦絲構成回路，外接變阻箱(外阻，Rex)并通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(data acquisition system，DAS)實時監(jiān)測電壓數(shù)據(jù)并傳輸至電腦. 將裝置放置在磁力攪拌器上，陰、陽極攪拌轉(zhuǎn)速均為40～50 r/min，以使水樣充分混合. 反應器放置在恒溫室中，溫度保持在(25±2)℃. 陰極室加入50 mmol/L K3[Fe(CN)6]緩沖溶液，當溶液顏色由黃色變?yōu)榈G色時更換陰極液. 設置2個試驗組，每組2個平行，分別命名為閉路組(closed circuit MFC，MFC-C)和開路組(open circuit MFC，MFC-O).

接種污泥取自武漢市某污水處理廠的二沉池. 向MFC陽極室加入曝氮氣后〔ρ(DO)<1 mg/L〕的活性污泥和營養(yǎng)液的混合液(體積比為1∶2)以馴化產(chǎn)電菌，營養(yǎng)液的成分為CH3COONa、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、CaCl2·6H2O、MgSO4·7H2O和微量元素[24](營養(yǎng)液用蒸餾水配置，正式試驗時不含CH3COONa，以保證除底物外無其他外加碳源). 每隔1周更換陽極混合液，使產(chǎn)電菌在電極上富集，共接種4次，之后每3 d更換1次營養(yǎng)液，單個周期獲得穩(wěn)定電壓輸出即表示馴化完成. 整個馴化階段持續(xù)約1.5個月.

1.2 試驗設計

1.2.1EPS組分降解試驗

分別向陽極投加不同濃度的PN (protein，蛋白質(zhì))和PS (polysaccharide，多糖)作為反應底物，研究底物類型、底物濃度和外阻(Rex)對MFC系統(tǒng)產(chǎn)電性能的影響及其對底物的利用效率. 每種底物下設置3個處理批次，相應的進水ρ(CODCr)條件見表1，每批次試驗周期為1周，每個批次重復3次. PN用牛血清白蛋白(BSA)配制，PS用分析純葡萄糖配制.

表1 EPS組分降解試驗設計

1.2.2人工濕地堵塞物降解試驗

依次向陽極投加0.500、1.000、1.667、3.333、6.667 g/L人工濕地堵塞物〔取自某高速公路服務區(qū)人工濕地，經(jīng)烘干研磨過100目(0.15 mm)篩網(wǎng)后使用〕作為反應底物，根據(jù)預試驗結果將Rex條件設為500 Ω，研究MFC的產(chǎn)電性能及對堵塞物的降解效果. EPS組分降解試驗結果表明，在第3天電壓開始大幅下降，因此每批次試驗周期設置為3 d，試驗重復3次. 人工濕地堵塞物以EPS和無機物質(zhì)的總含量來表征，其中EPS采用“堿洗+熱堿+低速離心”方法提取[25]. 試驗所用堵塞物中無機物含量為36.50%，EPS組分含量：w(PN)為49.48 mg/g(73.26%)，w(PS)為15.44 mg/g(22.86%)，w(核酸)為2.62 mg/g(3.88%).

1.3 測定指標與方法

1.3.1產(chǎn)電性能

電壓通過數(shù)據(jù)采集器(型號R6016/U/C3，上海繼升電氣有限公司)測定，每10 s記錄一次并自動存入計算機中，分析數(shù)據(jù)時取10 min內(nèi)的平均值，采集精度為0.001 V. 極化曲線和功率密度曲線使用穩(wěn)態(tài)放電法[26]測定，依次調(diào)減Rex(從 9 000 Ω降至10 Ω)并記錄相應的電壓值，采用極化曲線斜率法計算Rint(系統(tǒng)內(nèi)阻，等于極化曲線斜率和陽極有效面積的比值).

1.3.2EPS組分分析

ρ(PN)采用考馬斯亮藍法測定〔以牛血清白蛋白(BSA)作為標準物質(zhì)〕[27]；ρ(PS)采用葡萄糖氧化法(H2SO4-蒽酮法)測定[1]；ρ(核酸)采用二苯胺法測定(以小牛胸腺DNA作為標準物質(zhì))[28].

1.3.3水質(zhì)指標

ρ(CODCr)采用HJ/T 399—2007《水質(zhì) 化學需氧量的測定 快速消解分光光度法》測定；ρ(TN)采用HJ 636—2012《水質(zhì) 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》測定；ρ(NH4+-N)采用HJ 535—2009《水質(zhì) 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》測定；ρ(NO3--N)采用HJ/T 346—2007《水質(zhì) 硝酸鹽氮的測定 紫外分光光度法(試行)》測定. 溶解性有機物通過總有機碳(total organic carbon, TOC)來衡量，采用《TOC分析儀燃燒法》測定.

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗組設置2個平行，每組試驗重復3次，取數(shù)據(jù)的平均值進行分析. 所有數(shù)據(jù)使用Origin 9.0軟件繪圖，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的One-way Anova法進行單因素方差分析.

2 結果與討論

2.1 EPS組分降解試驗

2.1.1產(chǎn)電性能

分別以PN和PS為底物的MFC系統(tǒng)電壓輸出如圖2所示，電壓曲線均呈先迅速升高至峰值后穩(wěn)定一段時間再快速下降的趨勢. 在單批次試驗臨近結束時，電壓輸出接近于零，說明此時陽極室內(nèi)的碳源被消耗殆盡，微生物活性下降，幾乎不產(chǎn)生電能. 底物為PN時，3個處理批次的最大電壓(Vmax)分別為600、635和302 mV，電壓穩(wěn)定時間(stable time，ST)分別持續(xù)約2.2、2.0和1.0 d；底物為PS時，相應的Vmax分別為584、590和306 mV，ST分別持續(xù)約0.7、1.8和1.2 d. 對比分析可發(fā)現(xiàn)，底物類型對系統(tǒng)電壓輸出有一定影響，底物為PN時MFC的Vmax略高于底物為PS條件下，前者的ST也較后者的略長. 此外，底物為PN時，輸出電壓受到底物濃度的影響，當?shù)孜餄舛仍黾?.5倍(由200 mg/L增至500 mg/L)時，Vmax增加5.8%；而底物為PS時，其濃度對Vmax影響不大. 當保持底物類型和底物濃度不變、Rex增加9倍(由100 Ω增至 1 000 Ω)時，Vmax分別增加110.26%(PN)和92.81%(PS). 同時，ST受Rex的影響，Rex減小時，電路電流增大，ST縮短，底物降解速率加快.

圖2 以PN和PS為底物的MFC-C系統(tǒng)輸出電壓Fig.2 Voltage output of MFC-C system with substrates of PN and PS

以PN和PS為底物的MFC系統(tǒng)極化曲線和功率密度曲線如圖3所示. 由圖3可見，底物為PN時，3個處理批次的開路電壓(OCV)分別為577、767和551 mV，最大功率密度(Pmax)分別為55.88、161.10和77.01 mW/m2，系統(tǒng)內(nèi)阻(Rint)分別為212.5、112.5和125.0 Ω；底物為PS時，相應的OCV分別為671、660和674 mV，Pmax分別為50.06、112.24、104.40 mW/m2，Rint分別為262.5、125.0和137.5 Ω. 對比分析可知，底物類型對OCV、Pmax和Rint均有一定影響. 底物為PN時，OCV隨著底物濃度和Rex的增大而增加，底物濃度增加1.5倍時，OCV增加32.93%；Rex增加9倍時，OCV增加39.20%. 底物為PS時，3個處理批次的OCV并無明顯差異.Pmax隨底物濃度和Rex的增大而增加，底物濃度增加1.5倍時，Pmax分別增加188.30%(PN)和124.21%(PS)；Rex增加9倍時，Pmax分別增加109.19%(PN)和7.51%(PS). 底物為PN時，Pmax隨著底物濃度的增大而增加，這與Heilamnn等[29]的研究結論“一定底物濃度范圍內(nèi)，MFC的Pmax與底物濃度成正比”相一致，但Pmax低于單室BSA-MFC的Pmax〔(354±10)mW/m2〕，可能是由于質(zhì)子交換膜的存在增大了系統(tǒng)內(nèi)阻.Rint不受Rex影響，但與底物濃度有關，該研究中，底物濃度增加1.5倍時，Rint分別減小47.06%(PN)和52.38%(PS)，這與郭昌梓等[30]的研究結果“MFC的Rint隨底物濃度的增大而減小”相一致.

圖3 以PN和PS為底物的MFC-C系統(tǒng)極化曲線和功率密度曲線Fig.3 Polarization curves and power density curves of MFC-C system with substrates of PN and PS

該試驗結果表明，MFC系統(tǒng)的產(chǎn)電性能受底物類型、底物濃度及Rex的影響較大. MFC陽極微生物對PS的利用速率較快，由于PN需要被分解為小分子含氮物質(zhì)之后方可為微生物利用，因此以其為底物時MFC可在更長時間內(nèi)穩(wěn)定運行. EPS中的主要組分PN和PS均可作為MFC的底物并被有效利用，說明MFC可降解剩余污泥或人工濕地堵塞物等含EPS的物質(zhì)并同步產(chǎn)能.

2.1.2EPS組分利用效果

圖4 以PN和PS為底物的MFC-C和MFC-O系統(tǒng)出水ρ(PS)Fig.4 The PS in the effluent of MFC-C and MFC-O systems with substrates of PN and PS

不論底物為PN還是PS，所有批次的出水中均檢測不到PN，PN去除率均達100%，微生物分泌的PN極少. 但以PN為底物時，出水中可檢測到PS，應為微生物所分泌. 各批次出水中的ρ(PS)如圖4所示. 由圖4可以看出，當?shù)孜餅镻N時，各處理批次MFC-C出水ρ(PS)均小于MFC-O，進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，PN-1和PN-2處理批次MFC-C和MFC-O的出水ρ(PS)之間均不存在顯著性差異(P>0.05)，PN-3處理批次MFC-C和MFC-O的出水ρ(PS)之間存在顯著性差異(P<0.05). 當?shù)孜餄舛仍黾?.5倍時，ρ(PS)分別增加107.85%(MFC-C)和78.55%(MFC-O)；Rex增加9倍時，ρ(PS)分別增加415.85%(MFC-C)和294.29%(MFC-O). 當?shù)孜餅镻S時，PS去除率均在95%以上，但MFC-C和MFC-O之間不存在顯著性差異(P>0.05). 系統(tǒng)對PS的去除率隨底物濃度的增大而提高，但幾乎不受Rex的影響.

單個試驗周期內(nèi)，PN和PS幾乎可以全部被微生物利用，這與單組試驗臨近結束時系統(tǒng)電壓輸出為零的試驗結果一致. 陽極微生物對PN的利用率高于PS，這可能是由于PS的大尺寸和凝膠化行為導致其更難被生物降解[4-5]. EPS產(chǎn)量隨食微比(F/M)的增大而增加[31]，底物濃度增大時，出水ρ(PS)增加.Rex較大時，大部分電子消耗在電路的輸送過程中，微生物基于自身保護機制，在不利環(huán)境條件下傾向于分泌更多的EPS[32]，因此出水ρ(PS)隨Rex的增大而增加. 底物類型對EPS分泌有一定影響，這與已有研究結果[33-35]一致. 同時，該結果也表明MFC形成的微弱電場在一定程度上可抑制PS的分泌.

2.1.3污水處理性能

測定各處理批次出水pH和電導率(SPC)如圖5所示. 由于微生物利用陽極底物進行代謝活動過程中產(chǎn)生H+，因此兩個試驗組出水pH均低于進水. 各處理批次出水pH和SPC均表現(xiàn)為MFC-O>MFC-C，底物類型、底物濃度和Rex對出水pH和SPC的影響較小. 底物為PN時，各處理批次MFC-C和MFC-O的pH均存在極顯著性差異(P均小于0.01)，PN-1(P<0.05)和PN-3(P<0.01)的MFC-C和MFC-O的SPC均存在顯著性差異. 底物為PS時，PS-3的MFC-C和MFC-O的pH存在極顯著性差異(P<0.01)，各處理批次MFC-C和MFC-O的SPC均存在極顯著性差異(P均小于0.01).Rex減小時，MFC-C和MFC-O的出水pH差值和SPC差值均增大，可能是由于Rex減小導致電流增大，更有利于產(chǎn)電菌的生長繁殖，從而產(chǎn)生更多H+，遷移的電子數(shù)也越多. 開路條件下電流幾乎為零，因此其出水的pH和SPC均高于MFC-C.

圖5 以PN和PS為底物的MFC-C和MFC-O系統(tǒng)出水pH和SPCFig.5 pH and SPC in the effluent of MFC-C and MFC-O systems with substrates of PN and PS

圖6 以PN和PS為底物的MFC-C和MFC-O系統(tǒng)出水ρ(CODCr)、ρ(TN)、ρ(NH4+-N)和ρ(NO3--N)Fig.6 ρ(CODCr), ρ(TN), ρ(NH4+-N) and ρ(NO3--N) in the effluent of MFC-C and MFC-O systems with substrates of PN and PS

各處理批次出水ρ(CODCr)、ρ(TN)、ρ(NH4+-N)和ρ(NO3--N)如圖6所示. 底物為PN時，各處理批次CODCr去除率均在85%以上；底物為PS時，各處理批次CODCr去除率均在80%以上，這與MFC對PN的利用率略高的結論一致. 底物為PN時，保持底物濃度不變，當Rex減小時，電流增大，陽極生物膜上產(chǎn)電菌的氧化能力增強，氧化陽極底物的能力也增強，對CODCr的去除率提高，這與Jang等[36]的研究結果“CODCr的去除率隨Rex的增大而減小”相一致. 除PN-3的MFC-C和MFC-O出水中ρ(NH4+-N)存在顯著性差異(P<0.05)外，其余各批次的出水指標之間均不存在顯著性差異. 底物為PN時，各處理批次出水的ρ(TN)和ρ(NH4+-N)均表現(xiàn)為MFC-C>MFC-O，ρ(NO3--N)則表現(xiàn)為MFC-CMFC-O，ρ(NH4+-N)則表現(xiàn)為MFC-C

研究[39]發(fā)現(xiàn)，在有機碳源存在的環(huán)境中，厭氧氨氧化與反硝化反應能同步進行，且表現(xiàn)出一定的相互促進作用. 陽極室為厭氧環(huán)境，硝化反應受到抑制，隨著反應進行，陽極液中有機碳源減少，反硝化反應受抑制，脫氮效率下降. 但各試驗組的TN和NH4+-N均可實現(xiàn)一定程度的去除，說明陽極室內(nèi)有可能存在其他的脫氮途徑，但是否為厭氧氨氧化途徑有待進一步證實，如通過對陽極石墨氈做高通量測序測定是否存在厭氧氨氧化菌[40].

2.2 人工濕地堵塞物降解試驗

2.2.1產(chǎn)電性能

EPS可作為微生物的碳源和能量來源，微生物可以利用其他微生物分泌的EPS進行代謝活動[41]. 底物為人工濕地堵塞物時MFC系統(tǒng)的輸出電壓如圖7(a)所示. 由圖7(a)可見，電壓曲線呈先迅速升至峰值后穩(wěn)定一段時間再下降的變化趨勢，這與底物為PN或PS時的電壓變化趨勢一致. 除堵塞物投加量為0.5 g/L時Vmax(480 mV)較低外，隨著投加量的增加，Vmax(約750 mV)變化均不大，但電壓穩(wěn)定的時間隨投加量增加而略有延長，投加量為0.5 g/L時電壓幾乎沒有穩(wěn)定期，而投加量為6.667 g/L時在單個試驗周期內(nèi)電壓幾乎不下降. 營養(yǎng)物質(zhì)充足時，微生物生長活性高，產(chǎn)電量增加，隨著營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡，微生物生長延緩，產(chǎn)電量下降. 此外，溫度、pH、ρ(DO)等生存因子也會影響微生物生長，即增長到一定量后便進入穩(wěn)定期，且MFC反應器特性也會制約產(chǎn)電性能，因此產(chǎn)電量不會無限增大. 用蒸餾水配制陽極液，投加的堵塞物是微生物生長的唯一外部碳源. 在無其他外加碳源的條件下，EPS降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)可以作為細胞生長的碳源和能量來源[42]，進一步說明陽極產(chǎn)電菌可以降解CW堵塞物并同步產(chǎn)能.

堵塞物投加量為6.667 g/L時，MFC系統(tǒng)的OCV為0.677 V，Pmax為12.25 mW/m2，Rint為 1 112.5 Ω〔見圖7(b)〕. 相較于底物為純EPS組分，底物為堵塞物時MFC的Rint約為前者的5倍，Pmax約為前者的10%. 進一步說明底物類型會影響MFC產(chǎn)電性能，這是因為人工濕地堵塞物成分復雜，大部分為難降解有機物且被疏水性EPS成分所包裹，不易溶解疏散[11]，難以被微生物直接利用，電子傳遞阻力大，Rint增大，MFC產(chǎn)電性能下降.

圖7 以堵塞物為底物的MFC-C系統(tǒng)輸出電壓、極化曲線和功率密度曲線Fig.7 Voltage output, polarization curve and power density curve of MFC-C system with substrates of clogging matter

堵塞物投加量/(g/L)：Ⅰ—0.500； Ⅱ—1.000； Ⅲ—1.667； Ⅳ—3.333； Ⅴ—6.667.圖8 以堵塞物為底物的MFC系統(tǒng)進出水ρ(EPS)Fig.8 EPS in the influent and effluent of MFC-C and MFC-O systems with substrates of clogging matter

2.2.2堵塞物EPS組分分析

為分析MFC對堵塞物EPS組分的處理效果，測定了各試驗組進出水EPS及TOC濃度. 由圖8可見，除堵塞物投加量為0.5和1.0 g/L外，其他試驗組出水EPS的含量均表現(xiàn)為MFC-O

圖9 以堵塞物為底物的MFC系統(tǒng)進出水ρ(TOC)Fig.9 TOC in the influent and effluent of MFC-C and MFC-O systems with substrates of clogging matter

微生物分泌的EPS可分為可生物降解和不可生物降解兩類. 研究[44]顯示，從新鮮好氧顆粒污泥中提取的EPS中約50%的PS和30%的PN可被生物降解，50%以上的EPS不可被生物降解，而從放置一段時間的好氧顆粒污泥中提取的EPS幾乎不能被生物降解，且PS的平均生物降解速率非常慢. 由于該試驗中所用的堵塞物為采樣后冷凍保存較長時間且經(jīng)過烘干研磨等預處理過程的樣品，所以對其降解利用率不高. 但若將MFC與CW耦合原位降解堵塞物，則可排除預處理等過程的影響，提高EPS降解利用率. 此外，由于EPS的主要成分為帶負電荷的腐殖質(zhì)、蛋白及多糖類物質(zhì)，而MFC陽極作為原電池中的負極，形成的微弱電場可通過排斥作用促使負電荷微粒從堵塞物聚集體中反向擴散，加速其分散[17]. 同時，利用脂肪族組分、碳氫化合物和碳水化合物在MFC中更易被水解和生物降解[45]，可通過MFC強化去除堵塞物中的芳香族蛋白質(zhì)和可溶性微生物副產(chǎn)物. 電場的存在可強化微生物代謝的電子傳遞過程，從而促進新陳代謝，提高微生物活性，加快微生物降解EPS.

3 結論

a) MFC系統(tǒng)的產(chǎn)電性能受底物類型、底物濃度及Rex的影響較大，且以PN為底物時的影響更為明顯：底物濃度增加1.5倍時，Vmax和Pmax分別增加5.8%和188.30%；Rex增加9倍時，Vmax和Pmax分別增加110.26%和109.19%. 當?shù)孜餄舛群蚏ex在一定范圍內(nèi)時，MFC的產(chǎn)電性能與二者均呈正相關.

b) 陽極微生物可完全利用PN，但同時會分泌PS，且分泌量隨底物濃度和Rex的增大而增加；此外，MFC-C的出水ρ(PS)低于MFC-O，表明MFC形成的微弱電場在一定程度上抑制了PS的分泌.

c) MFC的輸出電壓隨著堵塞物投加量的增加而增加，Pmax為12.25 mW/m2. MFC在降解人工濕地生物堵塞物并同步實現(xiàn)電能回收方面具有較大應用潛力.