馮微宏, 肖 勇, 錢燕華, 許秋瑾

1.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院全球健康中心，江蘇 南京 211166 2.無錫市疾病預防控制中心，江蘇 無錫 214023 3.中國環(huán)境科學研究院,環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

諾如病毒是一種重要的水傳播病毒，被認為是最常見的急性胃腸炎的病原學病毒[1-3]. 諾如病毒是無包裹的單股正鏈RNA病毒，其基因組可以分成3個開放閱讀框(ORF). 基于其衣殼蛋白核酸序列的不同，諾如病毒可以分為5個不同的基因型(G Ⅰ～G Ⅴ)，其中G Ⅰ型和G Ⅱ型通常感染人類，而且這兩型可進一步細分為至少31個不同的基因亞型[4]. 諾如病毒主要通過食物、水和人傳人3種途徑傳播[5-6]，人傳人可以借由直接接觸患者或吸入患者嘔吐物的氣溶膠兩種途徑而感染[7].

自1992年諾如病毒全基因組序列被解析以來，雖然諾如病毒的分子檢測方法已經(jīng)改進了很多，但水中諾如病毒的檢測始終是個難點，成為諾如病毒暴發(fā)疫情溯源的瓶頸. 自然水體中諾如病毒檢測困難，主要原因是：①目前，諾如病毒還不能進行體外培養(yǎng). ②原始水樣中病毒含量很低，低于常規(guī)熒光定量RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應)方法的檢測下限. ③水中存在一些抑制RT-PCR的物質(zhì)[8-9]. 目前最廣泛使用的水體中諾如病毒的富集方法是病毒吸附-洗脫(VIRADEL)法，其可以分為陰離子膜吸附-洗脫法和陽離子膜吸附-洗脫法[10-11]. 這兩種方法針對不同病毒的回收效果及使用成本等方面有差異，為找到一個各方面更適用于日常水體中諾如病毒富集的吸附-洗脫方法，該研究模擬比較了這兩種方法對水體中諾如病毒的回收效果、富集消耗時間、適用場景及使用成本的差異，旨在優(yōu)選水源性諾如病毒富集方法，為水源水、飲用水以及自然景觀水體(如湖濱浴場)中諾如病毒的常規(guī)監(jiān)測貯備檢測技術(shù)和方法.

1 材料與方法

1.1 GⅡ型諾如病毒標本液的制備

取1 mL由無錫疾病預防控制中心微生物檢驗部實驗室檢出的GⅡ型諾如病毒陽性的糞便標本，加到10 mL滅菌水中，充分振蕩混勻后，以 4 000×g離心5 min，取上清液通過0.45 μm針頭式過濾器過濾，再用PBS (磷酸緩沖鹽溶液)稀釋后，分裝成每管1.0 mL，作為原始病毒標本液，并于-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2 試劑與儀器

One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自寶日醫(yī)生物科技(北京)有限公司(貨號：RR064a)；RNA提取試劑盒Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit 購自德國Qiagen公司(貨號：52906)；含有GⅡ型諾如病毒特征性片段的質(zhì)粒由無錫疾病預防控制中心微生物檢驗部構(gòu)建，構(gòu)建步驟參考文獻[12]；UNIQ-200柱式質(zhì)粒DNA中量抽提試劑盒購自上海生工生物科技有限公司(貨號：B511241)；DH5α感受態(tài)細菌購自上海生工生物科技有限公司(貨號：B528413)；ABI 7500 Fast型實時熒光PCR儀購自美國ABI公司；0.45 μm硝酸纖維素濾膜(直徑14.2 cm)購自美國Millipore公司(貨號：HAWP14250)；0.45 μm針頭式過濾器購自上海生工生物有限公司(貨號：F513143-0001)；HE120型水平式核酸電泳儀購自上海天能科技有限公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(貨號：5407000368)和Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀(貨號：10021)購自德國Eppendorf公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司(貨號：5838)；WT600-2J型精密蠕動泵及配套硅膠軟管購自保定蘭格恒流泵有限公司；PurLVsTM真空抽濾系統(tǒng)購自北京卓誠惠生生物科技有限公司；NanoCeram濾器購自美國Argonide公司；Centricon Plus-70超濾管購自美國Millipore公司(貨號：C3043).

1.3 引物探針

根據(jù)Trujillo等[13]的研究，合成引物探針，用于熒光定量PCR檢測GⅡ型諾如病毒和含有GⅡ型諾如病毒特異性片段的標準質(zhì)粒. 引物探針由上海生工生物科技公司合成. 熒光定量RT-PCR所用引物和探針序列見表1.

表1 熒光定量RT-PCR所用引物及探針序列

注：** 表示G Ⅱ TaqMan?探針；5′端用JOE熒光素標記，3′端用BHQ淬滅基團標記.

1.4 RNA提取及熒光定量PCR檢測

RNA提取按照Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒操作說明書進行. RNA提取完成后進行熒光定量RT-PCR檢測. 熒光定量RT-PCR檢測通過ABI 7500Fast型實時熒光PCR儀完成. 反應體系：2×Quantitech probe RT-PCR Master Mix 12.5 μL、Cog 2F (10 μmol/L) 1 μL、Cog2R (10 μmol/L) 1 μL、Ring 2 (10 μmol/L) 0.5 μL、Quantitech RT Mix 0.25 μL、Rnase-free H2O 7.25 μL和模板RNA 2.5 μL. 反應參數(shù): 50 ℃ 30 min, 95 ℃ 15 min, 94 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，60 ℃收集熒光信號.

1.5 病毒濃度及Ct值計算

將含GⅡ型諾如病毒特異性擴增片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細菌，經(jīng)培養(yǎng)擴增后，使用UNIQ-200柱式質(zhì)粒DNA中量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，采用Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀測定濃度，質(zhì)?？截悢?shù)根據(jù)質(zhì)粒分子量及阿伏伽德羅常數(shù)(NA)進行計算，計算公式：

CdsDNA=50×OD260 nm×Dr

(1)

CNplasmid=CdsDNA/Mrplasmid×NA

(2)

式中：CdsDNA為雙鏈DNA (dsDNA)的濃度，μg/mL；OD260 nm為dsDNA在260 nm紫外波長下的吸光度(1個吸光度值相當于50 μg/mL的雙鏈DNA)；Dr為dsDNA的稀釋倍數(shù)；CNplasmid為質(zhì)粒(plasmid)的拷貝數(shù)濃度，copies/L；Mrplasmid為質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量，g/moL；NA為阿伏伽德羅常數(shù)，取值為6.02×1023copies/mol.

將原始質(zhì)粒濃度〔通過式(1)(2)計算得到〕稀釋至8×1010copies/μL，再將其進行10倍逐級稀釋為9個濃度(分別為8×109、8×108、8×107、8×106、8×105、8×104、8×103、8×102、8×101copies/μL)；用熒光定量PCR分別測得不同濃度下的Ct(熒光定量PCR中達到設定閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù))，并重復3次. 取熒光擴增曲線Ct平均值和對應拷貝數(shù)的lg對數(shù)平均值繪制標準曲線，用熒光定量RT-PCR檢測保存的諾如病毒懸液，根據(jù)標準曲線算出所含諾如病毒的拷貝數(shù).

1.6 陰離子膜吸附-洗脫法

取0.1、1、5 mL病毒原液，加入到1 L滅菌水中，加入50 mL 2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+最終濃度為0.1 mol/L，充分攪拌混合均勻；采用真空抽濾使水樣以0.1 L/min的速率通過孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素濾膜；將膜浸入pH為3.5的鹽酸溶液中，5 min后取1/4大小的膜剪碎(最后病毒量換算時再乘以4)，用1 mL Tr alk洗脫液(0.05 mol/L KH2PO4, 1.0 mol/L NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 9.2)4 ℃浸泡過夜洗脫，取200 μL洗脫液提取RNA，用熒光定量PCR進行檢測. 試驗重復3次，陰性對照使用1 L無病毒的無菌水，在核酸提取中加入陽性質(zhì)粒作為陽性對照.

1.7 陽離子膜吸附-洗脫法

取0.1、1、5 mL病毒原液，加入到1 L滅菌水中，加入50 mL濃度為2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+最終濃度為0.1 mol/L，充分攪拌混合均勻；以0.1 L/min的速率通過Nanoceram濾器，過濾完成后將Nanoceram濾膜浸泡于200 mL TGBE洗脫液(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.05 mol/L甘氨酸, 3% beef extract, pH為9.5)中，4 ℃浸泡過夜洗脫，洗脫液接著用Centricon plus-70超濾管以3 000×g離心30 min 濃縮至1 mL，取200 μL洗脫液提取RNA，用熒光定量PCR進行檢測. 試驗重復3次，陰性對照使用1 L無病毒的無菌水，在核酸提取中加入陽性質(zhì)粒作為陽性對照.

1.8 病毒回收率計算

病毒回收率計算公式：

Recovery=CNrecovered sample/CNunseeded sample×100%

(3)

式中：Recovery為病毒回收率，%；CNrecovered sample為富集后病毒濃縮液中的病毒拷貝數(shù)濃度，copies/L；CNunseeded sample為富集前病毒原液中的病毒拷貝數(shù)濃度，copies/L.

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計學分析. 病毒回收率和病毒濃度符合正態(tài)分布，采用平均值±標準差表示. 以病毒拷貝數(shù)的lg對數(shù)值為橫坐標，以Ct為縱坐標，建立標準曲線，并計算R2. 使用方差分析比較陰離子膜吸附-洗脫法和陽離子膜吸附-洗脫法兩種方法所得回收率的差異，如P<0.05認為有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與分析

圖1 病毒絕對定量標準曲線Fig.1 Standard curve of absolute virus quantification

2.1 病毒拷貝數(shù)對數(shù)值與Ct呈線性關(guān)系

10倍梯度稀釋后的GⅡ型諾如病毒質(zhì)粒標準品在PCR擴增時呈現(xiàn)典型S型曲線，通過計算分析可得，在8×101～8×1010copies/μL時，標準曲線圖見圖1. 病毒拷貝數(shù)對數(shù)值lg (x)與Ct(y)關(guān)系為y=-3.567 8x+47.638(R2=0.997 6，P<0.001)，其可用于諾如病毒拷貝數(shù)的絕對定量. 病毒標本液提取核酸后用熒光定量PCR檢測獲得其Ct，并通過上述標準曲線計算出病毒拷貝數(shù)濃度為7.1×106copies/μL，為便于計算，用滅菌蒸餾水稀釋至8×105copies/μL，作為試驗中病毒原液使用.

2.2 兩種不同方法的回收率

隨著模擬水樣中病毒濃度的降低，兩種方法的回收率都相應降低. 當原始模擬水樣中病毒濃度為8 copies/μL時，無論使用陰離子膜吸附-洗脫法還是陽離子膜吸附-洗脫法，3次重復試驗都沒有檢測到病毒，而當原始模擬水樣中病毒濃度為80、400 copies/μL時，陰離子膜吸附-洗脫法回收率分別為22.2%±4.1%和36.8%±6.2%；陽離子膜吸附-洗脫法回收率為17.4%±1.47%和28.8%±6.1%(見表2). 綜上，陰離子膜吸附-洗脫法病毒回收率高于陽離子膜吸附-洗脫法(P<0.05).

表2 兩種水源性諾如病毒富集方法的回收率比較

3 討論

諾如病毒以高濃度存在于隱形感染者，即無典型癥狀感染者的糞便中，并主要通過糞口途徑污染食物和水[14]. 水體中諾如病毒的檢測已成為水源性諾如病毒暴發(fā)疫情的關(guān)鍵溯源手段[15]. 迄今為止，已有許多研究關(guān)注于各種類型水環(huán)境，如未經(jīng)處理的廢水、地表水、地下水、海水、甚至飲用水中諾如病毒的檢測[10,16-17]. 由于在水體中諾如病毒濃度極低，所以在熒光定量PCR檢測之前水體的富集濃縮成為必不可少的步驟. 之前很多研究使用了兩級，即初級濃縮和次級濃縮的病毒富集法，其中VIRADEL法是初級濃縮中常用的方法，而超濾法和聚乙二醇(PEG)絮凝法是次級濃縮中常用的方法[10,18]. VIRADEL法基本過程是先使含有病毒的水體通過吸附性濾器，使病毒吸附在多孔濾膜上，再使用緩沖液從濾膜上洗脫病毒. VIRADEL法中最常使用兩種濾膜，即陰離子膜和陽離子膜，因而VIRADEL法又可分為陰離子膜吸附-洗脫法和陽離子膜吸附-洗脫法. 陰離子膜最常用的是硝酸纖維素膜，陽離子膜常用的包括1MDS膜[19]和Nanoceram膜[20]. 1MDS陽離子膜是美國環(huán)境保護局(US EPA)推薦用于富集水中腸道病毒的濾膜[21]，但是1MDS價格非常昂貴[22-23]，而美國Argonide公司生產(chǎn)的由納米氧化鋁纖維組成的NanoCeram膜比1MDS膜便宜很多，而且在與1MDS膜的比較研究中發(fā)現(xiàn)其對自來水和河水中的腸道病毒的回收率高于1MDS膜[20,24]. 而硝酸纖維素膜的價格更為便宜，其只相當于Nanoceram膜價格的1/8，從使用成本上看陰離子膜吸附-洗脫法要比陽離子膜吸附-洗脫法便宜很多.

從洗脫過程來比較，對于陰離子膜吸附-洗脫法而言，在濃縮之前，需要添加陽離子鹽(如MgCl2或AlCl3)來促進帶負電的病毒與膜的結(jié)合[25]，在洗脫之前需要再用酸(H2SO4或HCl)洗去膜上吸附的陽離子(Mg2+或Al3+)以提高病毒回收率[26]，該研究中加入的陽離子選用MgCl2而不選用AlCl3的理由，在于有研究[27]發(fā)現(xiàn)隨著水樣體積的增加，添加AlCl3后水中病毒的回收率急劇下降，而添加MgCl2后病毒的回收率仍然保持穩(wěn)定. 對陽離子膜吸附-洗脫法而言，在濃縮過程中無需加鹽或酸化，但陰離子膜吸附-洗脫法在初級濃縮后，洗脫液體積可以小至1 mL，無需再進行次級濃縮而可以直接抽提核酸，相反陽離子膜吸附-洗脫法在初級濃縮后，洗脫體積仍為200～300 mL，為達到1 mL最終體積(保證兩種方法最終洗脫液體積相同)，仍需要進行次級濃縮，PEG沉淀和超濾都是可選的方案[17,28-29]，但使用超濾法更合適，因為PEG沉淀需要4 ℃攪拌過夜再離心取沉淀溶解，而超濾只需離心30 min即可完成使得最終洗脫液體積在1 mL之內(nèi)[30-32]，另外PEG中存在一些會抑制RT-PCR的物質(zhì)[33]. 總體而言，陽離子膜吸附-洗脫法比陰離子膜吸附-洗脫法消耗時間更長，另外在次級濃縮中陽離子膜吸附-洗脫法需要用到超濾管和低溫高速離心機，這無形增加了很多使用成本.

洗脫液的選擇方面，De-Keuckelaere等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Tr alk洗脫液(磷酸鹽洗脫液)用來洗脫陰離子膜所得的病毒回收率較高，而TGBE用于洗脫陽離子膜所得的病毒回收率較高. 該研究結(jié)果顯示，陰離子膜吸附-洗脫法的回收率總體稍高于陽離子膜吸附-洗脫法，與De-Keuckelaere等[34]研究結(jié)果一致. De-Keuckelaere等[34]研究發(fā)現(xiàn)，使用陰離子膜吸附-洗脫法的鼠諾如病毒(MNV-1)的回收率(平均為21.87%)要遠高于陽離子膜吸附-洗脫法(1MDS膜)，其回收率平均僅為1.63%,而該研究顯示陽離子吸附-洗脫法的病毒回收率要遠高于De-Keuckelaere 等[34]的研究，原因可能是：①鼠諾如病毒和人諾如病毒的帶電特性差異較大；②Nanoceram 膜的病毒回收率要高于1MDS膜[24].

從使用場景來比較，對陰離子膜吸附-洗脫法而言，需要事先在水體中加入陽離子(Mg2+)，很難進行現(xiàn)場處理，而陽離子膜吸附-洗脫法無需對水體進行任何處理，可適用于現(xiàn)場采樣處理，但陽離子膜吸附-洗脫法相比陰離子膜吸附-洗脫法要多一個次級濃縮的步驟，這一過程在采樣現(xiàn)場無法完成，所以總體而言二者都更適用于實驗室操作. 綜合富集效果、操作步驟和檢測成本方面的考量，陰離子膜更適用于實際檢測工作中水體的人諾如病毒富集. 此次方法學研究的結(jié)果，將在自然環(huán)境水體中諾如病毒的監(jiān)測和研究中開展進一步的驗證和不斷改進.

4 結(jié)論

a) 從富集效果來比較，陰離子膜吸附-洗脫法回收率分別為22.2%±4.1%和36.8%±6.2%，陽離子膜吸附-洗脫法回收率分別為17.4%±1.5%和28.8%±6.1%，說明前者對病毒的富集回收率顯著高于后者(P<0.05).

b) 從操作步驟來比較，陰離子膜吸附-洗脫法比陽離子膜吸附-洗脫法更簡便，耗時更短.

c) 從成本來比較，陰離子膜吸附-洗脫法總體比陽離子膜吸附-洗脫法低很多.

d) 綜合富集效果、耗費時間和成本等因素，陰離子膜吸附-洗脫法比陽離子膜吸附-洗脫法更適用于常規(guī)水體監(jiān)測中水源性諾如病毒的富集.