王 楠，王傳寬，潘小承，白尚斌

1.東北林業(yè)大學(xué)生態(tài)研究中心, 黑龍江 哈爾濱 150040 2.浙江農(nóng)林大學(xué), 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 311300

隨著氮氧化物、硫化物等污染物排放的急劇增加，酸雨對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響已成為全球性環(huán)境問題[1]. 浙江省位于我國華東沿海酸雨區(qū)的東南部，降水pH年均值為4.88，平均酸雨率為70%，酸雨污染較嚴(yán)重[2]. 酸雨沉降到地表，危害植物生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致土壤酸化，改變土壤生態(tài)環(huán)境[3-4]，對(duì)土壤的理化性質(zhì)和土壤微生物群落及功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)而復(fù)雜的影響[5]. 土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的生態(tài)因子之一，其通過分解土壤有機(jī)質(zhì)、驅(qū)動(dòng)土壤物質(zhì)循環(huán)，在有機(jī)質(zhì)和無機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化中起著重要作用[6]. 在森林生態(tài)系統(tǒng)中，由于微生物結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易受環(huán)境條件的影響而發(fā)生變異，并能產(chǎn)生快速而靈敏的應(yīng)答反應(yīng)[7]. 張瓊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同強(qiáng)度的酸雨對(duì)土壤微生物的影響效應(yīng)不同，其影響機(jī)理較為復(fù)雜. 因此，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)酸雨的響應(yīng)機(jī)理研究顯得尤為必要.

常綠闊葉林作為亞熱帶獨(dú)特的地帶性植被類型，物種組成豐富，是全球亞熱帶生物多樣性保護(hù)中心[9]，在全世界生態(tài)系統(tǒng)碳、氮循環(huán)過程中扮演著重要的角色[10]. 此外，茂密的樹冠和巨大的根系在氣候調(diào)節(jié)、涵養(yǎng)水源、水土保持等方面也發(fā)揮著重要的生態(tài)效能[11]，在亞熱帶地區(qū)生態(tài)環(huán)境平衡的維持中具有不可替代的作用.

常綠闊葉林和毛竹林是浙江省天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)典型的植被類型，毛竹(Phyllostachysedulis)為禾本科剛竹屬，屬于典型的無性系繁殖[12]，不僅具有很強(qiáng)的水平擴(kuò)展能力，而且生長(zhǎng)迅速，常綠闊葉林在遭受持續(xù)干擾后，很容易被周邊毛竹嚴(yán)重入侵，對(duì)亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性造成潛在的威脅[13]. 因此，該研究以浙江省杭州市臨安天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)特殊森林類型毛竹入侵常綠闊葉林形成的竹闊混交林為對(duì)象，利用新一代高通量基因測(cè)序技術(shù)，通過分析酸雨脅迫對(duì)土壤細(xì)菌的種類以及它們之間的相對(duì)豐度和進(jìn)化關(guān)系的影響，探討酸雨脅迫下竹闊混交林土壤細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子之間的內(nèi)在聯(lián)系，這對(duì)我國酸雨背景下常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)微生物群落及功能的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)及生態(tài)意義，可為進(jìn)一步研究毛竹入侵和酸雨的雙重影響奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)域位于浙江省天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(30°18′30″N～30°21′37″N、119°24′11″E～119°27′11″E)，總面積為 4 300 hm2，屬于中型野生植物類型自然保護(hù)區(qū). 海拔一般在300～500 m之間，中亞熱帶向北亞熱帶過渡型氣候，該區(qū)年均氣溫8.9～15.8 ℃，最冷月氣溫2.6～3.4 ℃，極端最低氣溫-20.2 ℃，最熱月氣溫19.9～28.1 ℃，極端最高氣溫38.2 ℃. 多年平均降雨量為 1 400 mm，多年平均無霜期為209～235 d. 土壤類型為亞熱帶紅黃壤[14].

1.2 樣地的設(shè)計(jì)及樣品的采集

該試驗(yàn)于2017年3月在浙江省杭州市臨安天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)毛竹向闊葉林?jǐn)U張區(qū)域布設(shè)3塊試驗(yàn)樣地，每個(gè)樣地寬5 m、長(zhǎng)25 m. 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，在每塊樣地內(nèi)各設(shè)置3個(gè)5 m×5 m的樣方，樣方間用0.5 cm厚、30 cm高的PVC板隔開，以防止樣方之間進(jìn)行水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，共計(jì)9個(gè)模擬酸雨試驗(yàn)樣方. 在樣方離地高度2 m處設(shè)置透明聚氯乙烯遮雨棚，以減少自然降雨對(duì)樣地的影響. 根據(jù)杭州臨安酸雨成分配置酸雨母液[15]，再用母液與去離子水配成相應(yīng)pH的模擬酸雨. 設(shè)置對(duì)照(CK)、T1(pH=4.0)、T2(pH=2.5)3個(gè)處理，其中對(duì)照為當(dāng)?shù)氐奶烊缓?，pH為5.5. 根據(jù)臨安市歷年年均酸沉降量，計(jì)算得到每次每個(gè)樣方每10 d噴淋酸雨量為10 L[16].

于2018年6月土壤微生物量較大時(shí)進(jìn)行土壤采集. 分別在每個(gè)樣方的四角與中心布設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，采集5～15 cm的土壤樣品，挑出石塊、凋落物和植物殘?bào)w等雜物. 將采集的土壤樣品分為兩份裝入無菌自封袋中，一份置于4 ℃電子恒溫箱中，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)；另一份過2 mm篩網(wǎng)，并儲(chǔ)存于-80 ℃的冰箱中，用于提取土壤基因組DNA[17].

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH用土水比1∶2.5浸提，電位法測(cè)定；土壤w(TN)、w(OC)采用元素分析儀測(cè)定；w(DOC)采用高純度水浸提，取上清液過0.45 μm濾膜后使用元素分析儀測(cè)定；w(AN)采用堿解蒸餾法測(cè)定；w(MBC)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，通過公式w(MBC)=EC/0.45(EC為熏蒸和未熏蒸樣品浸提液測(cè)定的有機(jī)碳含量差值)計(jì)算得出；w(MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，通過公式w(MBN)=EN/0.54(EN為熏蒸和未熏蒸樣品浸提液測(cè)定的有機(jī)氮含量差值)計(jì)算得出[18-19].

1.4 土壤細(xì)菌DNA提取與PCR擴(kuò)增

按照E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒(Omega U.S. Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA)說明書抽提基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量.

引物設(shè)計(jì)：用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]. PCR試驗(yàn)擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL FastPfu Polymerase，10 ng 模板 DNA. PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型(ABI,USA). PCR反應(yīng)參數(shù)：①95 ℃持續(xù)3 min；②95 ℃持續(xù)30 s，55 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)45 s，27個(gè)循環(huán)；③72 ℃持續(xù)10 min，10 ℃持續(xù)到儀器停止運(yùn)行. 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物[21]，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，利用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進(jìn)行檢測(cè)定量，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫，利用上海美吉生物公司Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序.

1.5 數(shù)據(jù)處理

基于Illumina PE300測(cè)序，首先將獲得細(xì)菌的FASTQ原始序列文件，使用QIIME(version 1.9.1，http://qiime.org)進(jìn)行序列拆分和質(zhì)量控制. 利用FLASH(version 1.2.11，http://ccb.jhu.edu)軟件對(duì)質(zhì)控序列進(jìn)行雙端拼接，并去除序列長(zhǎng)度小于200 bp、平均質(zhì)量得分小于20 bp的序列信息. 過濾read尾部質(zhì)量值在20 bp以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后質(zhì)量在50 bp以下的序列；根據(jù)兩端序列之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)序列拼接(merge)成一條序列，overlap長(zhǎng)度需大于10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向.

全部分析在運(yùn)算分類單位OTU(operational taxonomic unit)的相似水平為97%條件下進(jìn)行. 使用USEARCH軟件(version 7.0，http://diver 5.com)對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分及生物信息統(tǒng)計(jì)；以最小的序列數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品序列數(shù)取整抽平，用MOTHUR(version 1.30.2，http://mothur.org)軟件計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的α多樣性指數(shù)，包括Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)，各指數(shù)的計(jì)算方法見文獻(xiàn)[22]. 使用SPSS軟件(IBM SPSS Statistics 22 for WINDOWS)進(jìn)行土壤理化性質(zhì)的顯著性檢驗(yàn)，不同處理下的平均值在5%的顯著性水平下做LSD(Least significant difference)多重比較. 利用R語言Venn Diagram包繪制文氏圖；基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)使用 R2.15.3 軟件的vegan包進(jìn)行，使用vegan包中的“ANOSIM”和“ADONIS”函數(shù)進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性檢驗(yàn). 利用Canoco 4.5軟件對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子進(jìn)行冗余分析(RDA). 用Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)土壤細(xì)菌群落α多樣性與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性，細(xì)菌相對(duì)豐度和土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)性采用Spearman進(jìn)行，利用Python 2.7軟件對(duì)細(xì)菌屬水平作LEfSe(LDA Effect Size=4.0)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

通過表1比較發(fā)現(xiàn)，T1處理下土壤平均pH比CK處理低13.77%，T2處理下土壤pH比CK處理低31.36%；T1處理下土壤w(TN)、C/N、w(OC)、w(DOC)、w(AN)、w(MBC)和w(MBN)分別是CK處理的1.38、1.01、1.40、0.81、1.21、0.96和0.84倍，T2處理下土壤w(TN)、C/N、w(OC)、w(DOC)、w(AN)、w(MBC)和w(MBN)分別是CK處理下的1.68、1.03、1.73、0.50、1.40、0.90和0.68倍. 由此可見，酸雨脅迫對(duì)毛竹闊葉混交林土壤理化性質(zhì)和微生物量具有顯著影響(P<0.05).

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過Miseq高通量測(cè)序并優(yōu)化后，3個(gè)不同處理樣地的9個(gè)土壤樣品共獲得455 392條修剪序列數(shù)，平均堿基長(zhǎng)度為412.25 bp，其中堿基長(zhǎng)度為401～440 bp的序列數(shù)占總序列數(shù)的99.81%(見表2).

通過Venn圖可以直觀比較3種處理下土壤樣品OTU組成的相似性和重疊情況. 由圖1可見，在97%的相似水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，土壤OTU數(shù)量隨著酸雨強(qiáng)度的增加而逐漸降低. 全部樣地的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目為 4 284 個(gè)，其中共有的OTU分布數(shù)目為 1 018 個(gè)，約占總數(shù)的23.76%. T2處理下土壤獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目最少，約占總數(shù)的4.76%；CK處理下土壤獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目最多，約占總數(shù)的40.50%；T1處理下獨(dú)有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目為241個(gè)，約占總數(shù)的5.63%. T1處理與CK處理下土壤共有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目約占二者總數(shù)的32.92%；T1處理與T2處理下土壤共有的土壤細(xì)菌OTU分布數(shù)目約占二者總數(shù)的64.65%；T2處理與CK處理下土壤共有OTU分布數(shù)目約占總數(shù)的28.42%. 由此可以看出，T2處理與CK處理下土壤細(xì)菌的OTU分布差異最顯著.

表1 不同酸雨處理下土壤理化性質(zhì)和微生物量

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05). 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差. 下同.

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.3.1α多樣性分析

如表3所示，在97%分類水平下，不同酸雨處理下竹闊混交林之間的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)差異顯著(P<0.05). Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映群落豐富度，CK處理下Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)最大，說明CK處理下菌群豐富度最高. 不同酸雨處理下Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)雖然存在差異，但未達(dá)到顯著水平. Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)反映群落多樣性，CK處理下Simpson指數(shù)最大，Shannon-Wiener指數(shù)最小，說明CK處理下細(xì)菌多樣性最大. 各處理土壤樣品測(cè)序的覆蓋度最低為0.990，因此該測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映供試土壤樣品微生物的實(shí)際情況.

圖1 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌基因測(cè)序獲取的基因庫中獨(dú)有和共有OTUs分布的Venn圖Fig.1 Venn diagram showing the numbers of shared and exclusive OTUs of soil bacteria identified under the different acid rain treatments

2.3.2β多樣性分析

表3 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)

基于Bray-Curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)(PCoA)分析(見圖2)發(fā)現(xiàn)，主坐標(biāo)的前兩軸共解釋了69.04%的總方差，其中第一軸(PC1)和第二軸(PC2)分別解釋45.27%和23.77%的總方差. CK處理下土壤細(xì)菌OTU聚集在右側(cè)，而T1和T2處理下土壤細(xì)菌OTU聚集在左側(cè). 分別采用ANOSIM和ADONIS方法對(duì)CK處理與T1、T2處理下細(xì)菌群落進(jìn)行相似性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在施用酸雨后發(fā)生了顯著變化(P<0.05).

圖3 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌門水平群落組成Fig.3 Soil bacteria community composition of phylum level under the different acid rain treatments

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及屬水平差異分析

在相似水平為97%的條件下，對(duì)OTU的代表序列作分類學(xué)分析(見圖3). 結(jié)果表明，9個(gè)土壤樣品共檢測(cè)出 4 284 個(gè)OTUs分布，分屬于34個(gè)菌門. 其中，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)為3種處理共有的優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度>1%). 變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對(duì)豐度在CK處理下最高，酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的相對(duì)豐度在T2處理下最高.

對(duì)于LEFSe分析，首先使用非參數(shù)因子檢測(cè)具有顯著豐度差異特征，然后找到與豐度有顯著性差異的類群，最后采用線性判別分析(LDA)來估算每個(gè)組分(物種)豐度對(duì)差異效果影響的大小. 采用all-against-all 多組比較策略，在細(xì)菌屬水平上取相對(duì)豐度最大的前50個(gè)屬進(jìn)行LEfSe分析，LDA分值>4.0的物種見圖4. 在CK處理土壤中微球菌科、節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度變化顯著，為主要差異指示種；在T1處理中Elsterales目、Elsterales科和Elsterales屬的相對(duì)豐度變化顯著，為主要差異指示種.

注：相對(duì)豐度沒有顯著變化的為黃色，圓圈直徑的大小表示物種相對(duì)豐度的大小. 圖4 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌屬水平LEfSe分析(LDA閾值為4.0)Fig.4 LEfSe analysis of genus level of soil bacteria under the different acid rain treatments (LAD score is 4.0)

2.5土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落和多樣性的影響

采用Pearson法分析不同酸雨處理下竹闊混交林土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌α多樣性指數(shù)的相關(guān)性(見表4)，結(jié)果顯示，Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)均與pH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與w(TN)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與w(OC)、w(AN)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Simpson指數(shù)與w(TN)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與w(MBC)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).

冗余分析結(jié)果表明，4個(gè)排序軸的特征值分別為0.469、0.375、0.066、0.042(見圖5和表5)，其中第一軸是約束性排序軸，第一、第二排序軸共解釋了84.5%的脅迫變化，4個(gè)排序抽的特征值占總特征值的95.1%，4個(gè)排序軸共解釋了95.1%的脅迫變化和土壤因子關(guān)系. 為了研究影響毛竹闊葉混交林細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素，對(duì)8個(gè)土壤理化因子的邊際作用進(jìn)行檢驗(yàn)(見表6). 結(jié)果表明，土壤w(TN)(P=0.015，F(xiàn)=4.28)、w(AN)(P=0.014，F(xiàn)=4.96)和pH(P=0.046，F(xiàn)=3.77)對(duì)土壤細(xì)菌群落的構(gòu)建均有顯著影響.

Spearman分析反映了相對(duì)豐度位于前10位門水平上細(xì)菌與土壤理化因子的相關(guān)關(guān)系(見表7)，

表4 土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)、微生物量的相關(guān)系數(shù)

注：*表示P< 0.05； ** 表示P<0.01. 下同.

表5 冗余分析(RDA)結(jié)果

表6 土壤因子邊際作用檢驗(yàn)

表7 土壤細(xì)菌主要類群相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的Spearman相關(guān)性

由表7可見，變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對(duì)豐度均與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與w(TN)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的相對(duì)豐度均與pH呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與w(TN)呈顯著正相關(guān)(P<0.05).

3 討論

3.1 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌α和β多樣性

土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用. 土壤微生物參與有機(jī)質(zhì)分解、驅(qū)動(dòng)養(yǎng)分循環(huán)、活化土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素，被看作是土壤有效養(yǎng)分的源和匯[23]. 但是，土壤微生物群落是易變的，環(huán)境條件的變化會(huì)引起土壤微生物群落發(fā)生改變. 土壤微生物多樣性指數(shù)被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)功能的重要指標(biāo)[24]. 該研究表明，隨著酸雨處理強(qiáng)度的增加，土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)發(fā)生變化，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，這與張萍華等[25]的研究結(jié)果相似，隨著酸雨pH的下降，土壤中細(xì)菌數(shù)量均呈下降趨勢(shì). 孫巖等[26]研究發(fā)現(xiàn)，模擬酸雨處理會(huì)使玉米根際微生物的總量降低，群落的豐富度也降低. 由此證明，酸雨脅迫會(huì)抑制大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，酸雨強(qiáng)度增加會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌豐富度下降，改變土壤細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)，許多土壤細(xì)菌種群因不適宜酸性環(huán)境而死亡[27]. Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)受酸雨影響較小，表明土壤細(xì)菌的均勻度沒有出現(xiàn)顯著降低，這可能是由于一部分土壤細(xì)菌物種類消失后，土壤微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)度也隨之下降，適應(yīng)酸雨環(huán)境的土壤細(xì)菌群落因獲得了更多的營(yíng)養(yǎng)來源而不斷發(fā)展，使得土壤細(xì)菌群落均勻度沒有出現(xiàn)顯著下降.

主坐標(biāo)(PCoA)分析表明，酸雨處理組與對(duì)照組的土壤細(xì)菌群落在位置分布上存在顯著差異，表明酸雨脅迫使得土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化. 這與王曉彤等[28]的研究結(jié)果一致，他們利用主成分分析比較模擬酸雨對(duì)土壤稻田細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與酸雨處理組的空間距離相距甚遠(yuǎn)，模擬酸雨處理顯著改變了稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu). 可見，酸雨脅迫造成的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化主要是由于環(huán)境生態(tài)因子改變?cè)斐傻?

3.2 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化以群落組分改變?yōu)榛A(chǔ)，不同酸雨處理下土壤細(xì)菌群落組分的不同，預(yù)示著環(huán)境改變?yōu)檫@些細(xì)菌提供了特異性的生存條件，從而對(duì)菌群進(jìn)行選擇[29]. XIA等[30]對(duì)我國115個(gè)不同森林類型土壤樣品的研究發(fā)現(xiàn)，放線菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度較高. 高秀宏等[31]對(duì)大青山根際土壤細(xì)菌群落的研究表明，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門群落. 王怡等[32]通過對(duì)酸性農(nóng)作物土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度約占土壤總細(xì)菌的70%. 賀婧等[33]研究表明，秦嶺中段北坡不同海拔中變形菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度最高. 這說明在森林生態(tài)系統(tǒng)中變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門生態(tài)位較寬，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng). 該研究結(jié)果也表明，竹闊混交林土壤中變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門的相對(duì)豐度在3個(gè)處理中均為最高，是該地區(qū)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落. 綜上，不同類型土壤在門水平上有其自身的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，同時(shí)細(xì)菌類群也存在高度相似性，但不同類型土壤中細(xì)菌類群的相對(duì)豐度存在差異. 該研究中，與CK處理相比，模擬酸雨處理降低了變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度，提高了酸桿菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度.

在屬水平上采用LEfSe方法分析不同酸雨處理下土壤細(xì)菌群落組成的差異指示種(見圖4)，能夠在一定程度上反映出土壤的基本特征. 該研究中，在LDA分值>4.0的顯著性差異水平上，節(jié)桿菌屬和Elsterales屬的相對(duì)豐度變化顯著，說明不同酸雨處理下二者可作為土壤細(xì)菌群落組成的差異指示種. 節(jié)桿菌屬是根際促生菌[34]，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收. 該研究中，節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度在CK處理下最高，模擬酸雨降低了節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度，可能會(huì)抑制竹闊混交林根系的生長(zhǎng).

3.3 不同酸雨處理下土壤細(xì)菌與環(huán)境因子的關(guān)系

環(huán)境生態(tài)因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著影響[35]. Siles等[36]對(duì)不同pH的高山森林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與土壤pH密切相關(guān). SHEN等[37]研究了長(zhǎng)白山6種典型植被類型土壤細(xì)菌群落組成和多樣性隨海拔的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)土壤pH是驅(qū)動(dòng)土壤細(xì)菌分布的重要影響因子. 該研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌Ace指數(shù)(R=0.891)和Chao1指數(shù)(R=0.897)與土壤pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，由此推測(cè)，土壤pH下降會(huì)抑制一部分細(xì)菌的生長(zhǎng). 盡管土壤氮含量增加，可以為土壤細(xì)菌提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于酸雨作用，土壤細(xì)菌豐富度并沒有因?yàn)橥寥赖康脑黾佣岣?，這說明酸雨是制約土壤細(xì)菌多樣性的關(guān)鍵因素. 土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)與土壤w(TN)、土壤w(MBC)密切相關(guān)，這可能是酸雨導(dǎo)致了土壤氮含量提高，抑制了土壤細(xì)菌多樣性. 還有研究表明，酸桿菌門屬于嗜酸性細(xì)菌門，在酸性土壤環(huán)境中有較高的豐度[38]，這與該研究中酸桿菌門的相對(duì)豐度隨pH降低而升高的研究結(jié)果一致. 冗余分析和相關(guān)性分析表明，酸桿菌門相對(duì)豐度與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(見圖6和表7)，酸桿菌門在3個(gè)樣地的相對(duì)豐度分別為16.16%、21.51%和23.5%，隨著酸雨強(qiáng)度增大，酸桿菌門的相對(duì)豐度逐漸增加，酸性環(huán)境更有利于酸桿菌門細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，而變形菌門相對(duì)豐度逐漸下降，這可能與酸性條件下變形菌門處于競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)有關(guān)[39]. 王霞等[40]研究認(rèn)為，pH會(huì)影響綠彎菌門和放線菌門的分布，這與該研究中綠彎菌門和放線菌門的相對(duì)豐度隨pH在不同酸雨處理變化結(jié)果一致.

同時(shí)，土壤w(TN)、w(AN)與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性密切相關(guān). Sarathchandra等[41]研究表明，土壤中氮素含量變化會(huì)引起土壤微生物生物量、活性和群落組成的變化. SHEN等[42]在高寒苔原開展的小尺度海拔梯度研究發(fā)現(xiàn)，土壤氮是影響土壤細(xì)菌海拔梯度分布的關(guān)鍵環(huán)境因素. SHI等[43]研究發(fā)現(xiàn)，土壤氮的組分可能是影響北極苔原4種植被類型細(xì)菌結(jié)構(gòu)的重要影響因子. Magill等[44]研究發(fā)現(xiàn)，如果增加森林土壤氮含量，酸桿菌門的多樣性也會(huì)隨之增加. 該研究發(fā)現(xiàn)，w(TN)、w(AN)均與變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門的相對(duì)豐度存在極顯著(P<0.01)相關(guān)性，表明土壤w(TN)和w(AN)是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子. 此外，碳底物活性也是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素，該研究發(fā)現(xiàn)，土壤w(OC)、w(AN)均與綠彎菌門、酸桿菌門的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這與已有研究結(jié)果[45]一致. 綜上，土壤細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)均受到土壤環(huán)境因子的顯著影響，酸雨對(duì)毛竹闊葉混交林土壤環(huán)境因子的影響，導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能會(huì)阻礙闊葉林生長(zhǎng)和更新，提高毛竹競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，該結(jié)果為揭示毛竹入侵機(jī)制提供了新的理論依據(jù).

4 結(jié)論

a) 與CK處理相比，模擬酸雨顯著降低了竹闊混交林土壤細(xì)菌群落的OTUs數(shù)量、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)，Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)雖然存在差異，但差異不顯著.

b) 不同模擬酸雨處理下竹闊葉混交林土壤細(xì)菌的類群和相對(duì)豐度存在差別，測(cè)序共獲得34門96綱247目401科698屬，其中，變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門為3種處理共有的優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度均大于1%). 變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度在CK處理下最高，酸桿菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度在T2處理下最高. 節(jié)桿菌屬和Elsterales屬的相對(duì)豐度變化顯著，可作為酸雨脅迫下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的指示種.

c) 土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的冗余分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度均與pH呈顯著正相關(guān)，與w(TN)呈顯著負(fù)相關(guān)；酸桿菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度均與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與w(TN)呈顯著正相關(guān)，w(TN)、pH是影響竹闊混交林土壤細(xì)菌多樣性發(fā)生變化的重要因子.