何月秀，王崟寧，曾維晶，李安順，翟銳銳，李 娟，艾朝輝

(海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

刺芫荽又稱刺芹、洋芫荽、野芫荽、假芫荽、大葉芫荽、緬芫荽、阿佤芫荽等，傘形科刺芹屬多年生草本植物?？捎糜谥委煾忻昂?、哮喘、胃氣痛、產(chǎn)后出血、跌打損傷、腸炎腹瀉、消化不良、胸痛、麻疹內(nèi)陷、氣管炎、急性傳染性肝炎及蛇咬傷等癥[1-4]。刺芫荽中含有多種天然產(chǎn)物，如多糖、黃酮、月桂醇等化合物；越來越多的研究表明天然多糖類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫增強(qiáng)作用[5]。然而迄今為止國內(nèi)外對(duì)刺芫荽中多糖的含量和成分還沒有報(bào)道過，刺芫荽作為一種可貴的藥用植物資源，目前僅作為一種香料和調(diào)料食用，還沒有被全面地開發(fā)利用[1]。因此，開發(fā)和利用刺芫荽多糖在現(xiàn)實(shí)生活中具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)主要研究影響刺芫荽多糖提取的多種因素并優(yōu)化提取工藝，建立刺芫荽多糖的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海博訊生物醫(yī)療儀器有限公司；電子分析天平，瑞士METILER；TP電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；722型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇等試劑均為分析純，廣州化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水；刺芫荽，采摘于海南地區(qū)，經(jīng)鑒定為刺芫荽全草，干燥，粉碎至250～380 μm備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1刺芫荽多糖提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取1.0 g刺芫荽粉末于圓底燒瓶中，加入適量蒸餾水，于一定溫度中水浴提取一定的時(shí)間，離心，取上清液，濃縮，再加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇使多糖沉淀，于冰箱中放置24 h后，再次離心得到刺芫荽多糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻配置成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次吸取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個(gè)25 mL的容量瓶中，并依次加入1 mL 6%的苯酚，5 mL濃硫酸，搖勻后靜止30 min，加水定容，靜置室溫，以水為空白，于490 nm處測其吸光度。以橫坐標(biāo)為多糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=6.291 5c-0.032，R2=0.997 1，表明在0.008～0.064 g/L有良好的線性關(guān)系。

1.2.3刺芫荽多糖的測定

將提取的多糖加入適量蒸餾水配制成多糖溶液。取2.00 mL的多糖溶液于25 mL容量瓶中，按1.2.2步驟加入1 mL 6%的苯酚，5 mL濃硫酸等操作，并于490 nm處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算多糖含量。

多糖提取率=c×V×D/W

式中：c，多糖的濃度，g/L；V，多糖溶液的體積，mL；D，稀釋的倍數(shù)；W，刺芫荽粉末的質(zhì)量，g。

1.2.4單因素考察

以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定刺芫荽多糖的最佳提取工藝條件。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確精密稱取刺芫荽樣品1.0 g，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm處連續(xù)6次測定吸光度。

1.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取刺芫荽樣品1.0 g，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm處每隔30 min測定吸光度，連續(xù)測定3 h。

1.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取6份1.0 g刺芫荽樣品，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm處分別測定吸光度。

1.3.4加樣回收率試驗(yàn)

分別稱取6份1.0 g刺芫荽樣品，并分別加入適量多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm處測定吸光度。

1.4 含量測定

分別稱取3份1.0 g刺芫荽樣品，按照優(yōu)化后的提取工藝進(jìn)行提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1料液比對(duì)多糖提取率的影響

在提取時(shí)間為90 min，提取溫度為80 ℃。提取次數(shù)為1次，考察不同料液比對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。當(dāng)料液比在(1∶10)～(1∶30)，刺芫荽多糖的提取率隨著料液比的增大而不斷提高，當(dāng)料液比為(1∶30)～(1∶35)時(shí)，多糖提取率呈下降趨勢(shì)。

圖1 料液比對(duì)刺芫荽多糖的影響

2.1.2提取時(shí)間對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響

在提取溫度為80 ℃，料液比為1∶20，提取次數(shù)為1的條件下，考察不同的提取時(shí)間對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。提取時(shí)間為30～120 min時(shí)，刺芫荽多糖提取率的增加或減小幅度并不大，當(dāng)提取時(shí)間為120～150 min時(shí)多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間>150 min時(shí)，多糖提取率下降。

圖2 提取時(shí)間對(duì)刺芫荽多糖的含量的影響

2.1.3提取溫度對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響

在提取時(shí)間為90 min，料液比為1∶20，提取次數(shù)為1的條件下，考察不同提取溫度對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。提取溫度為60～75 ℃時(shí)，提取率呈上升趨勢(shì)，75～85 ℃時(shí)提取率下降，85～90 ℃時(shí)提取率上升。考慮到溫度過高容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，影響提取率，綜合各方面因素考慮，提取的最高溫度設(shè)定為90 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)刺芫荽多糖含量的影響

2.1.4提取次數(shù)對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響

在料液比1∶20，提取時(shí)間為90 min，提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同提取次數(shù)對(duì)刺芫荽多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，提取2次比只提取1次的提取率要高，提取3次與提取2次相比，提取率并沒有升高。

圖4 提取次數(shù)對(duì)刺芫荽多糖含量的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選

在單因素考察的基礎(chǔ)上，取刺芫荽粉末1.0 g，以多糖提取率為指標(biāo)，對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度及提取次數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選3個(gè)水平，按L9(34)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。選擇的因素水平見表1，L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 刺芫荽多糖提取正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

由表2可知，四個(gè)因素對(duì)刺芫荽多糖得率影響的主次順序依次為：提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比>提取溫度。刺芫荽多糖的最佳工藝組合為A1B3C3D2，即在料液比為1∶20，提取時(shí)間為150 min，提取溫度為80 ℃，提取兩次刺芫荽多糖的得率為12.78 mg/g。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)

測得的吸光度值分別為0.269、0.270、0.269、0.268、0.268、0.267，RSD=0.39%(n=6)。表明該方法具有較高的精密度。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

測得的吸光度值分別為0.267、0.275、0.271、0.273、0.269、0.264，RSD=1.49%(n=6)。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)提取的刺芫荽多糖溶液在3 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

測得的吸光度值分別為0.271、0.272、0.267、0.270、0.269、0.269，RSD=0.66%(n=6)，表明該方法具有較好的重復(fù)性，方法可靠。

2.3.4加樣回收實(shí)驗(yàn)(見表3)

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 含量測定

按正交優(yōu)化的提取工藝條件提取刺芫荽多糖3份樣品并按1.2.2方法測定吸光度，計(jì)算刺芫荽多糖含量分別為12.83、13.34、13.18 mg/g。

3 結(jié)語

用正交法優(yōu)化刺芫荽多糖的提取工藝，得到的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶20、提取時(shí)間150 min、提取溫度80 ℃、提取2次，使刺芫荽多糖得到充分地提取，再經(jīng)離心、濃縮、醇沉再離心等步驟得到刺芫荽多糖。按該工藝條件下多糖得率為12.78 mg/g。

采用苯酚-硫酸法對(duì)刺芫荽多糖含量進(jìn)行測定，其原理是多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定，并對(duì)此測定方法進(jìn)行了重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密性及加樣回收率考察，考察結(jié)果令人滿意，說明用苯酚-硫酸法測定多糖方法簡單可行、穩(wěn)定、可靠，可用于刺芫荽多糖的含量測定[5]。