葉成林，姚永華，陳 真，賈 麟

（1.上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院血液科，上海 200438；2.上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心腫瘤科，上海 201318）

血小板減少患者常以出血為表現(xiàn)，而其病因則以免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）為多見(jiàn)，但也有其他病因如骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）等，ITP 與以單純血小板減少為表現(xiàn)的MDS 在臨床表現(xiàn)上常難以鑒別，需要進(jìn)一步行骨髓形態(tài)學(xué)及骨髓病理檢查以明確。臨床上常用的石蠟包埋骨髓病理切片，由于其操作中需脫鈣等原因，細(xì)胞形態(tài)不易辨識(shí)，常不足以進(jìn)行鑒別診斷。相比傳統(tǒng)的石蠟包埋切片，骨髓活檢乙二醇-甲基丙烯酸酯（glycol-methacrylate,GMA）塑膠包埋切片中的造血細(xì)胞形態(tài)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)切片，便于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的辨識(shí)，尤其是GMA塑膠包埋過(guò)程控制在制冷體系下，使熱敏感抗原保留較佳。浦杰等[1]曾在52例血液病患者的骨髓活檢GMA 包埋切片中對(duì)14 種單克隆標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行觀察，證明該技術(shù)既可保留良好的抗原性，也有助于觀察免疫組織化學(xué)（免疫組化）標(biāo)志物相關(guān)的形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)。本研究通過(guò)骨髓活檢GMA 塑膠包埋技術(shù)結(jié)合巨核細(xì)胞免疫標(biāo)記方法，從47例以單純血小板減少為表現(xiàn)的患者中診斷出8例MDS 患者，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、資料

2014 年8 月至2018 年10 月期間，選取來(lái)我院門診就診及住院的47例臨床表現(xiàn)為單純血小板減少的患者，其中男性20例，女性27例，年齡為46～84歲，平均年齡為72歲。

二、方法

1.骨髓活檢GMA 塑膠包埋：參考《實(shí)用血液病骨髓病理學(xué)彩色圖譜》相關(guān)內(nèi)容[2]，制備包埋劑甲液和乙液。取固定好的骨髓活檢組織塊，浸于起始濃度為70%并逐級(jí)遞增的乙醇中進(jìn)行脫水；將脫水后的骨髓活檢組織塊用針頭挑入特制的聚乙烯模具中，用滴管吸取GMA 單體甲液裝滿模具，并放入4 ℃的冰箱中浸泡2 h；用帶8 號(hào)針頭的1 mL 注射器吸取乙液 （聚乙二醇和N-N 二甲基苯甲胺混合液），滴3 滴入模具中，用細(xì)玻璃棒迅速將甲、乙兩液攪勻，并將活檢塊擺正在模具底部中央，置于4 ℃冰箱內(nèi)，放置60 min 待其自聚；取出制作好的塑膠包埋塊，切割成3～4 μm 厚的切片。

2.免疫組化染色：選擇CD41 單抗免疫標(biāo)記染色以區(qū)分小微巨核等病態(tài)巨核細(xì)胞，選擇CD33 單抗標(biāo)記未成熟前體細(xì)胞異常定位 （abnormal localization of immature precursors,ALIP）結(jié)構(gòu)中的前體細(xì)胞，用堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase,APAAP） 方法染色，所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)DAKO 公司，操作步驟如下。將骨髓活檢組織切片從-20 ℃冰箱中取出后，在室溫下放置15～20 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗片3 次，再加入馬血清封閉20 min，依次加入一抗（鼠抗人單克隆抗體）、二抗（羊抗鼠免疫球蛋白）、三抗（APAAP 酶標(biāo)復(fù)合物），并分別于室溫下各孵化2 h、40 min 和40 min，最后滴加顯色液顯色20 min。

3.細(xì)胞遺傳學(xué)檢查：對(duì)骨髓活檢組織進(jìn)行染色體核型分析及MDS 相關(guān)基因檢查。檢查均送至上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程均符合細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

4.MDS 的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)：MDS 的診斷和分型均依據(jù)WHO（2016）的MDS 分型標(biāo)準(zhǔn)，其中骨髓任何系病態(tài)造血以病態(tài)發(fā)育細(xì)胞＞10%為標(biāo)準(zhǔn)[3]。

結(jié)果

一、診斷結(jié)果

在47例患者中，8例患者經(jīng)病理診斷診斷為MDS，占血小板減少總?cè)藬?shù)的17%，其中男性3例，女性5例，其余39例患者被診斷為ITP 或其他非血液系統(tǒng)疾病所致的血小板減少患者。8例MDS 患者中3例為MDS 伴單系病態(tài)造血（myelodysplastic syndrome-single lineage dysplasia，MDS-SLD），4例為MDS 伴多系病態(tài)造血（myelodysplastic syndrome with multilineage dysplasia，MDS-MLD），1例為5q-綜合征。3例患者在入院前已診斷或擬診為免疫性血小板減少性紫癜，但治療效果不佳。8例MDS 患者就診時(shí)的平均血小板計(jì)數(shù)為18×109/L [（9～30）×109/L]（見(jiàn)表1）。

二、骨髓活檢病理表現(xiàn)及免疫組化染色結(jié)果

骨髓病理檢查可見(jiàn)，粒系、紅系、巨核系和淋巴系細(xì)胞顯示良好，細(xì)胞形態(tài)清晰，5例患者表現(xiàn)為多系病態(tài)造血，3例患者表現(xiàn)為單系病態(tài)造血。6例MDS 患者的骨髓組織骨小梁間中心區(qū)可觀察到真性ALIP 結(jié)構(gòu)（即5～6個(gè)以上的未成熟前體細(xì)胞集聚），未成熟細(xì)胞的核膜清晰，可見(jiàn)核仁（見(jiàn)圖1A），并可見(jiàn)骨小梁旁同期幼紅細(xì)胞簇，主質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大、小簇ALIP 結(jié)構(gòu)，ALIP 結(jié)構(gòu)中粒系前體細(xì)胞呈CD33 染色強(qiáng)陽(yáng)性（見(jiàn)圖1B、1C）。

表1 患者基本情況及病態(tài)造血、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

8例MDS 患者均可觀察到巨核系病態(tài)造血，可見(jiàn)巨大巨核細(xì)胞（見(jiàn)圖1D），而免疫組化染色可見(jiàn)微巨核細(xì)胞（見(jiàn)圖1E），其數(shù)量超過(guò)巨核細(xì)胞總數(shù)的10%。2例患者的骨髓組織切片中可見(jiàn)網(wǎng)狀纖維（+）（見(jiàn)圖1F）。

三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

8例MDS 患者中有3例染色體核型分析及基因檢查異常，可見(jiàn)t（1，21）、5q-、7q-等（見(jiàn)表1）。

討論

單純血小板減少的患者在臨床上很常見(jiàn)，而以血小板減少為主要表現(xiàn)的MDS 與ITP 的鑒別方法目前主要集中在血清血小板生成素、外周血網(wǎng)織血小板以及骨髓細(xì)胞高碘酸希夫染色結(jié)果三方面。關(guān)于血清血小板生成素的水平差異，文瑞婷等[4]研究了117例血小板減少癥患者后發(fā)現(xiàn)，MDS 組、ITP組與正常對(duì)照組比較，血清血小板生成素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能需要在低增生MDS 及其他類型MDS 亞型間行分層研究。外周血網(wǎng)織血小板是骨髓釋放入血的含有少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及mRNA 的新鮮血小板，其數(shù)量反映了人體血小板的更新能力，ITP 患者發(fā)病時(shí)網(wǎng)織血小板減少。但研究發(fā)現(xiàn)，采用網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)鑒別MDS 與ITP 的作用有限[5]。MDS 患者有核紅細(xì)胞陽(yáng)性率較高，提示紅系存在病態(tài)造血，骨髓細(xì)胞高碘酸希夫染色陽(yáng)性者的骨髓巨核細(xì)胞總數(shù)及淋巴樣小巨核細(xì)胞數(shù)量及比例升高，但營(yíng)養(yǎng)性貧血等其他病因患者亦可呈現(xiàn)類似表現(xiàn)[6]。因此，臨床需要尋找更好的方法對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。

圖1 骨髓活檢組織病理圖片

一、骨髓活檢GMA 塑膠包埋

骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)檢查是血液病診斷的基本方法，而骨髓活檢組織檢查更容易發(fā)現(xiàn)骨髓的增生程度、基質(zhì)細(xì)胞、纖維化、細(xì)胞定位等方面的信息，尤其對(duì)于MDS，病態(tài)造血是其診斷的核心所在，對(duì)其診斷的意義更大[7]，將二者結(jié)合可以提高血液病的診斷率，減少漏診及誤診[8]。脫鈣的石蠟切片中細(xì)胞易皺縮，結(jié)構(gòu)易被破壞，而GMA 塑膠包埋材料技術(shù)為不脫鈣包埋技術(shù)，包埋過(guò)程控制在低溫-低氧環(huán)境下進(jìn)行，可有效防止熱損傷，熱敏感抗原保留較佳，這樣醫(yī)師不僅能觀察造血組織的結(jié)構(gòu)、清晰地分辨造血細(xì)胞的各個(gè)階段[9],還能結(jié)合免疫標(biāo)志物進(jìn)一步辨別特異性的巨核系病態(tài)造血表現(xiàn)，可更精確地作出診斷。

二、巨核細(xì)胞免疫標(biāo)記

有研究表明，在ITP 和MDS 患者中，巨核細(xì)胞的凋亡均呈現(xiàn)減少[10]，而巨核系病態(tài)造血，細(xì)胞多形性明顯，包括不產(chǎn)生血小板的巨大及雙核巨核細(xì)胞，極易與ITP 混淆。在病態(tài)造血的多種表現(xiàn)中，小微巨核細(xì)胞雖難以識(shí)別，但診斷特異度較高[11]。因此，正確識(shí)別巨核系病態(tài)造血是鑒別MDS 與ITP的關(guān)鍵。小巨核及微巨核細(xì)胞形態(tài)上難以被識(shí)別，產(chǎn)板是巨核細(xì)胞的特征，一定數(shù)量的小巨核細(xì)胞產(chǎn)板現(xiàn)象是巨核系病態(tài)造血的最重要特點(diǎn)，需要仔細(xì)觀察，避免疏漏。

通過(guò)免疫組化甚至涂片細(xì)胞化學(xué)染色的方法可以進(jìn)一步標(biāo)記巨核細(xì)胞。2010 年國(guó)際MDS 血液病理學(xué)工作會(huì)議建議，骨髓石蠟切片選擇1～2個(gè)巨核細(xì)胞標(biāo)志 物，包 括CD42b、CD61 及CD31 及CD41，而本研究中采用的CD41 免疫標(biāo)志物染色有助于識(shí)別小微巨核等病態(tài)巨核細(xì)胞，對(duì)巨核系病態(tài)造血的診斷有意義。

三、ALIP 結(jié)構(gòu)鑒別

ALIP 結(jié)構(gòu)也是支持MDS 診斷的重要依據(jù)，但需要注意部分低危MDS 中可見(jiàn)由紅系等前體細(xì)胞形成所謂“假性ALIP”結(jié)構(gòu)，其多呈小簇分布（未成熟前體細(xì)胞一般不超過(guò)5～6個(gè)），而行免疫組化檢測(cè)可幫助鑒別，明顯的大簇ALIP 結(jié)構(gòu)可見(jiàn)未成熟細(xì)胞集聚現(xiàn)象，有益于診斷MDS。本研究中圖1B和1C 亦證實(shí)了組成ALIP 結(jié)構(gòu)的是CD33 陽(yáng)性粒系前體細(xì)胞，為“真性”ALIP 結(jié)構(gòu)。浦權(quán)等[2]使用CD33 來(lái)標(biāo)記ALIP 結(jié)構(gòu)中的前體細(xì)胞，本研究沿用此方法，主要考慮CD33 在髓系早期細(xì)胞表達(dá)，在造血干細(xì)胞和成熟細(xì)胞上均不表達(dá)，特異度相對(duì)較高。有研究認(rèn)為，采用CD34 標(biāo)記ALIP 結(jié)構(gòu)中的前體細(xì)胞，其對(duì)MDS 的診斷意義更大[12]，但本研究考慮CD34 除在造血干和（或）祖細(xì)胞表達(dá)外，還可能在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，建議進(jìn)一步行研究探索以驗(yàn)證。

四、細(xì)胞遺傳學(xué)異常

特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)異常是診斷MDS 的另一個(gè)重要依據(jù)。本研究診斷的8例MDS 患者中有3例檢出染色體異常，包括5q-及7q-，但有1例患者為t（1，21），意義不明，有待進(jìn)一步研究。部分患者檢出有意義的細(xì)胞遺傳學(xué)異常（如5q-），但無(wú)病態(tài)造血證據(jù)，如符合診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)診斷為ITP，但需密切隨訪，不排除意義未明的克隆性血細(xì)胞減少，警惕病情轉(zhuǎn)化可能[13]。

MDS 作為血液腫瘤性疾病，常伴隨不同程度的網(wǎng)狀纖維增生，而ITP 則極少出現(xiàn)纖維化，即使出現(xiàn)，程度也較輕[14]。因此，是否存在網(wǎng)狀纖維增生可作為二者鑒別的證據(jù)之一。

總之，采用骨髓活檢塑膠包埋及免疫組化技術(shù)，結(jié)合骨髓穿刺細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，可以提高M(jìn)DS 的診斷率。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果提示巨核細(xì)胞病態(tài)造血，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一定比例的小、微巨核細(xì)胞，組成主體為粒系前體細(xì)胞且呈大簇分布的ALIP 結(jié)構(gòu)、網(wǎng)狀纖維增生，檢出MDS 常見(jiàn)的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，以上均高度提示MDS。尤其對(duì)于單純血小板減少且常規(guī)ITP 治療方案無(wú)效的患者，應(yīng)考慮MDS 的可能。但GMA 塑膠包埋及免疫組化技術(shù)相對(duì)石蠟包埋而言，對(duì)于技術(shù)層面的要求高，且不利于后續(xù)活檢組織的免疫組化染色，大規(guī)模普遍推廣受限，實(shí)用方面仍有很大的局限性，需要進(jìn)一步探討及研究。