朱 鵬，劉 琮，李 博，趙 晨，周 濤，周鵬飛，張 兵

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨外科，西安 710038)

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性骨腫瘤。骨肉瘤常發(fā)生在長骨的表面，常見于股骨遠(yuǎn)端脛骨近端和肱骨[1]?，F(xiàn)在骨肉瘤患者5年生存率接近70%[2]。但仍有部分骨肉瘤患者發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，常見為肺轉(zhuǎn)移，有證據(jù)[3]表明發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者5年生存率只有23%～44%。因此，尋找合適的骨肉瘤早期診斷的標(biāo)志物和有效治療的靶分子是進(jìn)一步提高骨肉瘤患者生存率至關(guān)重要的一步。

磷酸化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白1(stress-induced phosphoprotein 1，STIP1)能夠通過調(diào)節(jié)Hsp70和Hsp90連接及二聚化參與調(diào)控細(xì)胞的多個生理過程。近年來研究[4-5]證明STIP1在乳腺癌和胃癌中表達(dá)上調(diào)，然而STIP1在骨肉瘤中的表現(xiàn)尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)STIP1在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過STIP1基因沉默(si-STIP1)，可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，為STIP1在骨肉瘤診斷與治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人成骨細(xì)胞hFOB1.19、骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63和SaoS-2購自上海中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自和胎牛血清購自美國HyClone公司；Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；SBYR Green Mix購自德國Qiagen公司；si-STIP1及其陰性對照(si-NC)購自上海GenePharma公司；細(xì)胞裂解液和CCK-8細(xì)胞活性測定試劑盒購自上海Beyotime公司；Transwell培養(yǎng)板購于美國Corning公司；STIP1抗體、MMP2抗體、MMP9抗體、p-IGF1R抗體、IGF1R抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體和AKT抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購自北京ZSGB-BIO公司；ECL試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人成骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素的DMEM中，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，每2 d傳代1次。U2OS細(xì)胞分為2組：si-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC 48 h)和si-STIP1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-STIP1 48 h)。

1.2.2 實(shí)時定量PCR

按照TRIzol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定各組樣品的RNA濃度。按照說明書將5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各組設(shè)置3個復(fù)孔，使用ABI 7700熒光定量PCR儀器測定目的基因的表達(dá)。STIP1和β-actin引物序列由上海Sangon Biotech公司合成。PCR程序設(shè)置：預(yù)熱94 ℃ 2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算STIP1的基因表達(dá)水平。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

U2OS細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%，采用lipofectamine2000將si-NC和si-STIP1轉(zhuǎn)至細(xì)胞。48 h后，棄上清，各孔加入110 μL培養(yǎng)基(含10 μL CCK-8反應(yīng)液)，于37 ℃反應(yīng)2.5 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

U2OS細(xì)胞的遷移和侵襲采用Transwell方法測定，鋪有基質(zhì)膠的小室用于測定細(xì)胞侵襲能力，無基質(zhì)膠的用于檢測細(xì)胞遷移能力，每組設(shè)置3個復(fù)孔。各組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染si-NC和si-STIP1 48 h后，取細(xì)胞懸液接種于24孔板的上室中，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基，在37 ℃孵育24 h。用鑷子取出小室，4%甲醛溶液固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。各組隨機(jī)取5個視野在倒置顯微鏡下對遷移的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5 蛋白印跡

當(dāng)轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)基，并采用PBS清洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液，于冰上反應(yīng)15 min，收集細(xì)胞，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。各組蛋白的濃度采用BCA試劑盒測定。配置SDS-PAGE膠，各孔按照50 μg上樣量進(jìn)行加樣，然后電泳、轉(zhuǎn)膜。將膜置于5% BSA室溫封閉1 h，4 ℃過夜孵育STIP1、MMP2、MMP9、p-IGF1R、p-PI3K、p-AKT、IGF1R、PI3K、AKT、GAPDH和β-actin一抗。室溫孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗1 h，采用ECL方法顯色。采用ImageJ計算各條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 11.0軟件包用于分析數(shù)據(jù)。2組間比較采用SNK檢驗(yàn)，多組間比較采用ANVOA分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STIP1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)時定量PCR和蛋白印跡法測定結(jié)果顯示，在hFOB1.19、U2OS、MG63及SaoS-2細(xì)胞中STIP1基因表達(dá)水平分別為(1.02±0.03)、(4.26±0.46)、(3.15±0.32)和(3.86±0.36)，蛋白表達(dá)水平分別為(1.01±0.02)、(2.93±0.29)、(2.54±0.31)和(3.09±0.34)，與hFOB1.19細(xì)胞相比，其他細(xì)胞STIP1基因與蛋白相對表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

2.2 沉默STIP1抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC和si-STIP1后，實(shí)時定量PCR測定結(jié)果顯示，si-NC組和si-STIP1組STIP1基因表達(dá)水平分別為(0.98±0.03)和(0.34±0.09)，與si-NC組相比，si-STIP1組STIP1基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2A。此外，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-STIP1組U2OS細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，見圖2B。這些結(jié)果表明STIP1基因沉默抑制U2OS細(xì)胞增殖。

2.3 沉默STIP1抑制U2OS細(xì)胞的侵襲和遷移

將si-NC和si-STIP1轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞中，Transwell方法檢測結(jié)果顯示，si-STIP1組與si-NC組U2OS細(xì)胞遷移率分別為(54.29±7.59)%、(102.35±5.56)%，侵襲率分別為(61.29±6.94)%、(96.68±4.19)%，與si-NC組相比，si-STIP1組U2OS細(xì)胞遷移率、侵襲率均顯著降低(P<0.05)，圖3A—B。此外，蛋白印跡法測定結(jié)果顯示，si-NC組和si-STIP1組U2OS細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平分別為：(1.02±0.03)和(0.43±0.06)、(0.99±0.03)和(0.67±0.09)，與si-NC組相比，si-STIP1組MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，圖3C—D。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默STIP1抑制U2OS細(xì)胞的遷移和侵襲。

A：細(xì)胞遷移率；B：細(xì)胞侵襲率；C：MMP2蛋白表達(dá)水平；D：MMP9蛋白表達(dá)水平。*P<0.05與si-NC組比較。

圖3 沉默STIP1抑制U2OS細(xì)胞的侵襲和遷移

2.4 沉默STIP1抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路激活

IGF1R/PI3K/AKT信號通路參與調(diào)控細(xì)胞多種生物活性，本研究通過測定IGF1R、PI3K和AKT磷酸化水平考察STIP1調(diào)控U2OS細(xì)胞遷移和侵襲的可能機(jī)制，結(jié)果顯示，si-NC組和si-STIP1組U2OS細(xì)胞IGF1R、PI3K和AKT磷酸化蛋白表達(dá)水平分別為：(1.02±0.04)和(0.51±0.08)、(0.98±0.02)和(0.60±0.06)、(1.06±0.04)和(0.43±0.09)，與si-NC組相比，si-STIP1組p-IGF1R、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。表明沉默STIP1抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路的激活。

3 討論

骨肉瘤是一種常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，目前臨床采用手術(shù)聯(lián)合輔助化療能夠提高患者的生存率。但是也有部分患者因?yàn)槟退幮曰蛘叻无D(zhuǎn)移無法從中獲益。因此，尋找合適的靶分子用于骨肉瘤早期診斷以及后期治療中具有重要的臨床意義。

目前許多研究證實(shí)STIP1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[6]。卿海輝等[7]證實(shí)STIP1在惡性骨腫瘤中表達(dá)上調(diào)。本文也證明STIP1在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示STIP1參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因[8]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)包括MMP2與MMP9與腫瘤的發(fā)展呈現(xiàn)高相關(guān)性，它們不僅能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，還能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長、凋亡，血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。下調(diào)MMP2誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[9]。抑制MMP2和MMP9降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的遷移及血管生成能力[10]。以往的研究[11-12]證實(shí)，STIP1不僅能夠作為癌癥的潛在標(biāo)志物，還能夠正向調(diào)控肝癌以及腎癌細(xì)胞生長和遷移[13-14]。本文也證實(shí)沉默STIP1抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，以及MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果提示STIP1能夠正向調(diào)控癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移。

IGF-1R是一種受體酪氨酸激酶，在正常人體組織中廣泛表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，IGF-1R與人類腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。目前，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IGF1R在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著升高，抑制IGF1R阻礙骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[15]。此外，抑制PI3K/AKT信號通路激活阻礙骨肉瘤的發(fā)展[16]。近期，有研究[17]證實(shí)過表達(dá)STIP1激活PI3K/AKT信號通路。本文發(fā)現(xiàn)STIP1缺失抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路的激活，提示IGF1R/PI3K/AKT信號通路可能參與STIP1對骨肉瘤細(xì)胞生長和遷移的調(diào)控過程。

綜上所述，STIP1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，沉默STIP1顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長、侵襲和遷移能力，下調(diào)MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平。此外，STIP1缺失抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路的激活，提示IGF1R/PI3K/AKT信號通路可能參與STIP1調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生長和遷移的過程。本研究結(jié)果表明STIP1作為一個新穎的診斷和治療骨肉瘤的標(biāo)志物和靶點(diǎn)將成為可能。