何晨昊， 劉馨嶼， 鐘子琳， 陳建軍,3

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬第四人民醫(yī)院腦功能與人工智能轉化研究所，上海 200081；3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院兒科，上海 200072)

Usher綜合征(Usher syndrome, USH)是一種具有臨床和遺傳上異質性的常染色體隱性遺傳疾病。USH的特征是視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)，雙側感覺神經性聽力障礙和完整的前庭反應[1]。USH是人類先天性視力和聽力障礙最普遍的原因。在全球范圍內，USH的患病率約(3.3～6.4)/10萬[2]，目前為止，尚無治療USH的有效療法。

在臨床上，根據(jù)患者視力和聽力喪失的嚴重程度和進展情況，USH分為Ⅰ類USH(USH1)，Ⅱ類USH(USH2)和Ⅲ類USH(USH3)[3]。此外，大約20%～30%的病例為非典型性USH。USH1是這3種類型中最嚴重的一類，USH1患者患有先天性深度聽力喪失并一出生就失去視力。不同于USH1患者的先天性耳聾和失明，USH2患者在20歲左右才表現(xiàn)出輕-中度的聽力和視力喪失。USH2是USH中最常見的一類，占所有USH患者總數(shù)的一半以上[2,4]。USH3患者并非天生耳聾，通常是隨著年齡的增長逐漸喪失聽力和視力。

到目前為止，已鑒定出16個可能導致USH的基因(https:∥sph.uth.edu/retnet/sum-dis.htm)，其中3個基因[USH2A(Usherin)[5]，ADGRV1(adhesion G protein-coupled receptor V1)[6]和DFNB31(autosomal recessive deafness 31[7])]是USH2的致病基因。USH2A基因是USH2的主要致病基因，占所有USH2病例的74%以上[8]。該基因位于染色體1q41上，具有2種不同剪接的亞型。1998年，較短的USH2A亞型a首次被鑒定出來[5]，而van Wijk等[9]于2004年鑒定出更長的USH2A亞型b。迄今為止，已對USH2A亞型b的全部72個外顯子進行了大量的突變分析，發(fā)現(xiàn)了許多致病性突變(包括剪接位點處的剪接突變)[10-11]。USH2A亞型b編碼有5202個氨基酸的蛋白Usherin，它錨定在細胞膜上[12]，并特異性表達在哺乳動物的感光細胞的連接纖毛中，參與從內部到外部的物質運輸過程[13]。先前的研究表明，USH2A的突變可能導致非綜合征性隱性RP[14-15]。此外，USH2A基因也與觸覺敏感性和敏銳度有關[16]。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集

本研究選擇了8例就診于同濟大學附屬第十人民醫(yī)院的中國患者，經仔細的臨床檢查，根據(jù)患者的光學相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)和視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)結果，以及典型的RP眼底外觀，完整的前庭功能和感覺神經性聽力障礙診斷為USH2。來自NCBI的USH2A基因參考序列被用作對照。本研究符合《赫爾辛基宣言》所規(guī)定的標準，并獲得了同濟大學醫(yī)學院附屬同濟眼科研究所(中國上海)機構審查委員會(IRB)的批準。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 樣品制備和突變篩選

將所有患者及其親屬的外周血樣品收集在EDTA管中。根據(jù)制造商的說明，使用RelaxGene血液DNA系統(tǒng)的標準規(guī)程(TianGen，中國北京)提取基因組DNA。DNA樣品在使用前保存在-80℃的環(huán)境中。使用Primer3軟件(http:∥primer3.sourceforge.net/)設計了USH2A外顯子2至72(包括內含子-外顯子邊界)的特異性引物。通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的片段，PCR產物送去生工生物工程(上海)股份有限公司測序，之后利用Snapgene軟件將測序結果與已發(fā)表的USH2A基因的DNA序列(NCBI參考序列: NM_206933.3)進行比較，檢測有無堿基突變的情況。編號+1的cDNA對應于USH2A的ATG翻譯起始密碼子中的A。

1.3 錯義突變異致病性預測及分析

使用了幾種不同的計算機軟件，如SIFT和PROVEAN(http:∥provean.jcvi.org/genome_submit_2.php)、PolyPhen-2(http:∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和MutationTaster(http:∥www.mutationtaster.org/)來預測錯義變體的致病作用。使用Clustal Omega(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，通過將直系同源USH2A蛋白序列(包括小鼠、穴居人、牛、雞、獼猴和斑馬魚)與人類USH2A蛋白序列進行比對，評估物種間的進化保守性。

2 結 果

2.1 USH2患者的臨床特征

該患者年齡為20周歲，性別男，其眼底照片顯示了視網(wǎng)膜中不規(guī)則的色素團塊和視網(wǎng)膜血管的減少等典型的RP特征(圖1A)，患者的OCT成像表明其視網(wǎng)膜厚度明顯減少(圖1B)。此外，該患者有中等程度的聽力障礙，純音聽力圖測試分析顯示其雙側導氣和骨導聽覺下降，鼓室圖顯示為As型，這意味著中耳傳播系統(tǒng)活動受到限制。無法檢測到患者的ERG波振幅。這些特征支持了USH2的診斷。

2.2 USH2A突變的致病性分析

本研究將8例USH2患者的USH2A基因外顯子測序結果與已發(fā)表的USH2A基因的DNA標準序列進行了比對，并與SNP數(shù)據(jù)庫進行比對分析。最終在其中1例USH2患者身上，發(fā)現(xiàn)了2個新的雜合突變。根據(jù)計算機算法的結果，預測這2個新的雜合突變是致病性的，見表1。此外，在該患者身上，本研究還發(fā)現(xiàn)了其他6個已報道的被預測為非致病性的變化，見表2。對該患者的其他2個USH2致病基因ADGRV1和DFNB31的檢測結果顯示未發(fā)現(xiàn)有致病突變存在。

圖1 USH2患者的臨床檢查圖像Fig.1 Fundus images of the USH2 patientA: 該患者左眼眼底圖；B: 該患者右眼眼底圖；C: 該患者左眼的OCT圖像

這2個新的雜合突變分別是位于外顯子2上的移碼突變c.230dupA(Phe78Valfs*30)(圖2A)和位于外顯子19上的錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)(圖2B)。在該患者的母親身上，本研究也發(fā)現(xiàn)了錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)，但卻沒有發(fā)現(xiàn)移碼突變c.230dupA(Phe78Valfs*30)，在該患者的父親身上未發(fā)現(xiàn)有致病突變。該患者的父母都是表型正常的正常人，家系圖顯示該患者的遺傳遵循常染色體隱性遺傳方式，見圖3。

此外，本研究確定了這2個致病突變在usherin蛋白上的定位，見圖4A，對于錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)，使用Clustal Omega軟件分析比對不同物種(包括人類，穴居人，小鼠，獼猴，雞，斑馬魚和牛)之間USH2A序列，確定了其氨基酸序列具有高度的保守性，見圖4B。

表1 本研究中鑒定出的USH2A基因致病突變及其分析軟件預測結果Tab.1 Identified pathogenic variants in USH2A gene in this study and their prediction results from the analysis programs

表2 本研究中鑒定出的非致病性突變Tab.2 Variants predicted non-pathogenic in this study

圖2 本研究中鑒定的新的USH2A基因致病突變的測序分析結果Fig.2 Direct sequencing analysis of the novel pathogenic variantsin USH2A gene identified in this studyA: 新的移碼突變c.230dupA(Phe78Valfs*30)及其對應的野生型序列；B: 新的錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)及其對應的野生型序列

圖3 USH2患者的家系圖Fig.3 Pedigree of a Chinese USH2 patient’s family黑色代表患有USH2，白色為正常人；正方形表示男性，圓圈表示女性；M1: 新的移碼突變c.230dupA(Phe78Valfs*30)；M2: 新的錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)；WT: 野生型

圖4 致病突變的定位及氨基酸序列比對Fig.4 Location of pathogenic mutation and amino acid sequence alignmentA: 本研究中鑒定出的新的外顯子突變在USH2A亞型b上的定位；B: Clustal Omega軟件的氨基酸序列比對情況

3 討 論

目前，人們已經鑒定出了與USH相關的16個基因，其中3個是引起USH2的基因。在這3個基因中，USH2A可導致USH2病例的30%～40%和隱性RP病例的10%～15%[17]。Usherin定位于哺乳動物感光細胞中空間受限的膜微區(qū)[13]。先前的研究表明，先天性usherin蛋白突變可以誘導纖毛連接障礙，并最終導致失明[18]。

到目前為止，在中國患者中進行的USH2A突變篩查已經發(fā)現(xiàn)了25個致病突變[15,19-23]。在中國南方人群中，8.47%的散發(fā)性RP患者屬于USH[19]。本課題組在1例被診斷為USH2的中國患者的USH2A基因中鑒定了2個新的雜合致病突變(1個移碼突變和1個錯義突變)，并發(fā)現(xiàn)了其他6個已報道的非致病性的變化。

USH2A亞型b包含8個結構域，包括N端的信號肽(signal peptide, SP)，層粘連蛋白G樣結構域(laminin G-like domain, Lam GL)，層粘連蛋白N端(laminin N-terminal, Lam NT)，層粘連蛋白型EGF樣結構域(laminin-type EGF-like domain, EGF Lam)，Ⅲ型纖連蛋白(fibronectin Type Ⅲ, FN3)，層粘連蛋白G結構域(laminin G domain, Lam G)，跨膜區(qū)(transmembrane region, TM)和位于其C末端的PDZ結合模體(PDZ-binding motif, PBM)[9]。Usherin通過PBM結構域與harmonin和whirlin兩種支架蛋白的PDZ結構域相互作用整合到USH蛋白網(wǎng)絡中[24]。新的移碼突變c.230dupA(Phe78Valfs*30)在外顯子2上，定位于Lam G結構域，導致77個密碼子移碼并影響下游的85個氨基酸，可能導致usherin蛋白質結構發(fā)生重大變化。而新的錯義突變c.4085C>T(p.Pro1362Leu)發(fā)生在多個物種中高度保守的位置上，使亮氨酸代替原來的脯氨酸，定位于第3個FN3結構域。

在所有3個USH2致病基因中，USH2A基因是最重要的致病基因，由USH2A編碼的usherin蛋白對哺乳動物感光細胞的長期維持至關重要[13]。因此，鑒定USH2A基因中的致病突變不僅有助于闡明USH2A在USH2中的作用，而且對USH2的臨床診斷及尋找其有效的治療方法具有重大的意義。這些致病突變導致視覺缺陷和聽力障礙的具體原因目前尚未被闡明，有待進一步的功能和機制上的研究。

總之，本研究通過全外顯子測序鑒定了可能導致2型Usher綜合征的2個新的雜合USH2A基因致病突變。這一結果擴大了已知的USH2A基因致病突變的范圍。