武國利 張寧 田蜜 田征 許金鵬 馬競(jìng) 楊澤峰

【摘? 要】目的：探討miR-499a-5p通過靶向APC減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。方法：將心肌細(xì)胞H9C2作為對(duì)照組，將H2O2用400μmol/L處理后建立氧化應(yīng)激損傷模型作為模型組，對(duì)比兩組的組的細(xì)胞存活率、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、LDH活性、miR-499a-5p以及APC。結(jié)果：模型組LDH、MDA、APC明顯高于對(duì)照組，而SOD、miR-499a-5p明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：miR-499a-5p可調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的增殖、凋亡和氧化應(yīng)激，其能靶向抑制APC，臨床可將抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)作為保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的治療新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】氧化應(yīng)激;心肌細(xì)胞損傷;miR-499a-5p;APC

國內(nèi)有研究miR-449a在不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征、急性心肌梗死患者的血樣中高表達(dá)。也有研究中報(bào)道，miR-499a-5p在缺氧/復(fù)氧模型心肌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-499a-5p后細(xì)胞的凋亡率和乳酸鹽脫氫酶（LDH）活性均發(fā)生下調(diào)，其作用機(jī)制與靶向分化簇38（CD38）具有相關(guān)性，揭示miR-499a-5p可通過靶向CD38減輕缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞損傷[1]。還有報(bào)道，四甲基吡嗪（TMP）可以部分緩解缺氧引起的H9c2細(xì)胞中miR-449a的上調(diào)，并且miR-449a的過表達(dá)減弱了TMP對(duì)缺氧處理的H9c2細(xì)胞的治療作用，另外沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）是miR-449a的靶基因，揭示了TMP通過下調(diào)miR-499a，上調(diào)Sirt1，然后激活PI3K/AKT途徑部分緩解了缺氧引起的心肌細(xì)胞H9c2活力降低和凋亡促進(jìn)。這暗示了miR-499a在缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)[2]。本研究進(jìn)一步分析miR-499a-5p通過靶向APC減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，現(xiàn)具體匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1材料：大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自深圳市百恩維生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京明陽科華生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司;丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天研究所。

1.2方法：①建立心肌細(xì)胞H9c2損傷模型。H9c2細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用含DMEM培養(yǎng)基（10 %胎牛血清）進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)、傳代。將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組，將其用H2O2（100、200、400、800 μmol/L）處理4 h，檢測(cè)細(xì)胞的存活率，篩選400μmol/L的濃度建立氧化應(yīng)激損傷模型，標(biāo)記為模型組。②細(xì)胞存活率。采用CCK-8法檢測(cè)，收集細(xì)胞，取5×105個(gè)/mL的細(xì)胞200μL，加入96孔板，每孔再加入CCK-8反應(yīng)液20μL，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光值（A490）。存活率（%）= A490實(shí)驗(yàn)組/ A490對(duì)照組×100%。③miR-499a-5p、APC的表達(dá)檢測(cè)。采用qRT-PCR檢測(cè)。④SOD、LDH、MDA檢測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)，按試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組各項(xiàng)指標(biāo)比較，見表1。

3 討論

氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的重要因素之一，miRNA在心血管疾病中的致病作用已被大量研究證實(shí)，但miR-499a-5p在心肌細(xì)胞損傷中的功能尚未完全清楚。miR-499-5p在心室肌中高度表達(dá)，在缺氧或氧化應(yīng)激條件下，miR-499-5p表達(dá)明顯降低[3]。APC屬于一種生理抗凝劑，能夠發(fā)揮細(xì)胞調(diào)控作用，對(duì)心肌細(xì)胞的炎癥和凋亡有抑制作用。miR-499a-5p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中明顯降低，并能升高APC水平，達(dá)到抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)受損心肌細(xì)胞的作用[4]。

綜上所述，miR-499a-5p通過靶向APC減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，為臨床治療提供了新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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