呂貴萍　劉慧　陳玉　劉新橋　胡鑫　楊光忠

摘要：為建立人面果葉高效液相色譜（ HPLC）的指紋圖譜，采用Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），乙腈一甲醇一0.5%磷酸水溶液為流動相（梯度洗脫），在流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長289nm，進樣量10 μL的色譜條件下，以福木苷，GB2a.藤黃雙黃酮，GBla，volkensiflavone為對照品，繪制了44批人面果葉HPLC圖譜，通過相似度評價、主成分分析、聚類分析等3種方法對44批來源于不同產(chǎn)地、季節(jié)的人面果葉的指紋圖譜進行了研究。結果表明：44批樣品相似度在0.6～o.9之間，確定了11個共有峰，并指認其中4個峰，分別為福木苷、GB2a、藤黃雙黃酮、GBla;不同批次人面果葉的指紋圖譜均有一定差異，而且季節(jié)對人面果葉成分的影響大于產(chǎn)地的影響。該方法不僅可用于人面果葉的品種鑒別和質(zhì)量評價，還可為下一步制定人面果葉的質(zhì)量標準提供參考。

關鍵詞：人面果葉;藤黃雙黃酮;指紋圖譜;主成分分析;聚類分析

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2020） 2-0174-06

1 引言

人面果（Garcinia ranthochymus），又稱大葉藤黃，為我國傳統(tǒng)傣藥，是藤黃科（Guttiferae）藤黃屬（Garcin-ia）植物[1]，莖、葉和種子皆可入藥，具有清火退熱、驅(qū)蟲、解食物中毒作用[2]。本課題組前期研究表明，人面果葉的乙酸乙酯部位具有抗糖尿病和抗氧化作用[3-5]，其中人面果葉的乙酸乙酯部位以藤黃雙黃酮（fukugetin）、倭氏藤黃雙黃酮（volkensiflavone）、3，8雙柚皮素、白果素、福木苷、GBla、GB2a等雙黃酮類化合物為主[6，7]，在該有效部位有望開發(fā)出新型抗糖尿病藥物。為下一步深度開發(fā)人面果葉，所以有必要建立一種有效、可靠的分析方法作為人面果葉質(zhì)量控制的手段。指紋圖譜可以較為全面客觀地反映出中藥及民族藥復雜混合體系中各種化學成分濃度分布的整體狀況[8，9]，能夠有效的表征一個復雜的體系。本文收集了不同產(chǎn)地、不同季節(jié)的人面果葉，用高效液相色譜法建立了人面果葉指紋圖譜，進行相似度分析，并基于指紋圖譜信息進行化學模式識別研究，為人面果葉品種鑒別和質(zhì)量評價提供較全面的評價方法。

2 儀器與材料

2.1 儀器

高效液相色譜儀（DIONEX U- 3000，美國賽默飛世爾有限公司）;十萬分之一電子天平（AUW120D，島津）;萬分之一電子天平（CP224C，上海奧豪斯儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（DK- 98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司）;超聲儀（KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 試藥

色譜甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）;甲醇、甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;超純水為實驗室自制。福木苷（fukugiside）、GB2a、藤黃雙黃酮（fukugetin）、GBla、volkensiflavone對照品（實驗室自制，其結構1 H-NMR、13C-MNR、ESI- MS等確定，純度大于98%，結構見圖1）。

本研究中44批人面果葉分別購于昆明獵植中草藥銷售有限公司、廣西民族醫(yī)藥研究院、云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所。昆明獵植中草藥銷售有限公司采購的藥材由中國科學院昆明植物研究所韓春艷博士鑒定，廣西民族醫(yī)藥研究院采購的藥材由廣西民族醫(yī)藥研究院滕紅麗主任藥師鑒定，云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所采購的藥材由云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所趙應紅主任藥師鑒定，經(jīng)鑒定為藤黃科藤黃屬植物人面果（Garcin-isxanthochymus）葉，來源見表1。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;檢測波長：289 nm;流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;進樣量：10 μL;流動相：乙腈（A） -甲醇（B）一0.5%磷酸水溶液（C）;梯度洗脫程序，見表2。

3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取福木苷、GB2a，藤黃雙黃酮，GBla，volkensiflavone對照品，加95%甲醇溶解，必要時超聲處理，各自制成1 mg/mL的對照品溶液。

3.3 供試品的制備

取人面果葉粉末（過二號篩）約0.2 9，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入95%甲醇25 mL，稱重，水浴回流30 min，提取液冷卻，用95%甲醇補足失重，過濾，取續(xù)濾液（進樣前過0. 45 μm微孔濾膜），即得[10]。

3.4 方法學考察

3.4.1 精密度考察

取人面果葉粉末按照“3.3”法制備供試品溶液。按照“3.1”項下方法進行檢測，連續(xù)進樣6次。各個主要色譜峰保留時間RSD值為0.421%，峰面積RSD值0.284%，結果表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復性考察

取6份同一批次人面果葉粉末按照“3.3”法制備成供試品溶液。按照“3.1”項下方法進行檢測，各個主要色譜峰保留時間RSD值為1.328%，峰面積RSD值為1. 875%，結果表明此檢測條件重復性良好。

3.4.3 穩(wěn)定性考察

取人面果葉粉末按照“3.3”法制備成供試品溶液。在Oh，4h，8h，12 h，16 h，20 h，24 h后，按照“3.1”項下方法進行檢測。各個主要色譜峰保留時間RSD值為1.036%，峰面積RSD值為1.853%，結果表明樣品穩(wěn)定性較好。

3.5 人面果葉HPLC指紋圖譜的建立與共有峰的鑒定

取表1中44批人面果葉藥材，分別按“3.3”法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定。將得到的指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件中，得到44批人面果葉樣品的HPI_C指紋圖譜和對照品HPLC圖譜，見圖2～3。確定了11個共有峰，見圖3，共有峰的保留時間見表3。結合表3和圖3，可推斷6號共有峰為福木苷，8號共有峰為GB2a，9號共有峰為藤黃雙黃酮，10號共有峰為GBla。選擇9號峰（藤黃雙黃酮）作為參照峰計算各共有峰相對峰面積，共有峰的相對峰面積的RSD值在25. 44%～72. 83%之間，峰面積差異較大，結果見表4。

3.6 相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（ 2004A版）”，將44批樣品檢測指紋圖譜與對照指紋圖譜進行匹配，并進行相似度評價，各批樣品相似度在0. 65以上，結果見表5。將各季度樣品分別進行相似度比較，結果表明每個季度內(nèi)，各批次樣品相似度較高，這說明產(chǎn)地對樣品造成的影響較小，所以造成樣品整體相似度較低的原因是同一樣品在不同季度相似度較低造成的，結果見表6。

3.7 主成分分析

使用SPSS19.O統(tǒng)計軟件對44批樣品共有峰的相對峰面積（表4）進行主成分分析，結果見表7，碎石圖見圖4。由表7可知，前3個主成分因子的特征值>1，分別為5. 228、1.653、1.302，是影響人面果葉質(zhì)量評價的主要因子;3個主成分因子的累積方差貢獻率達到81. 821%，表明前3個主成分因子即可以代表44批藥材81%以上的變化情況。結合碎石圖可見曲線在成分3處存在明顯拐點，說明前3個主成分的分析結果基本顯示了不同批次人面果葉藥材質(zhì)量。針對前3個主成分進行分析，得到主成分得分、綜合得分和排序結果見表8。結果表明人面果葉綜合得分較高的前5位分別為編號S23、SI、S34、S12、S5批次的人面果葉，其中前四位為廣西那坡的樣品。綜合得分較低的后5位分別為編號S14、S37、S32、S36、S10批次的人面果葉。

3.8 聚類分析

采用離差平方和（ ward）法選取歐式距離平方和作為樣本的測度，對不同批次人面果葉進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖5。從圖中可以看出聚類趨勢可分為A、B兩大類，A大類下可分為3小類。其中B類主要以第三季度樣品為主，A大類下的3小類分別以第一季度、第二季度、第四季度為主?？傮w看來，分類趨勢與季節(jié)的關聯(lián)度比較大。這與相似度分析中的結果較為重合。

4 討論

本研究建立了人面果葉HPLC指紋圖譜，綜合運用相似度評價、主成分分析和聚類分析對44批不同產(chǎn)地、季節(jié)的人面果葉樣品進行了研究。根據(jù)保留時間，將已知的雙黃酮化合物與指紋圖譜中的共有峰進行對照，初步推斷在11個共有峰中有4個是已知的雙黃酮類化合物福木苷、GB2a、藤黃雙黃酮和GBla，此結果可以說明雙黃酮化合物為人面果葉的特征化合物。同時相似度評價與聚類分析的分析結果較為重合，結果顯示季節(jié)對人面果葉的影響大于產(chǎn)地的影響。主成分分析是從化學成分上揭示了不同產(chǎn)地和不同季節(jié)人面果葉之間的差異，并客觀地反映了人面果葉內(nèi)在質(zhì)量。該方法具有特征性強、穩(wěn)定可靠、重復性好的特點，可以用于人面果葉的質(zhì)量評價，為下一步制定人面果葉的質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

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作者簡介：呂貴萍（1994-），女，中南民族大學藥學院碩士研究生。

通訊作者：楊光忠（1968-），男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學的研究工作。