唐冰雯，郭俐麟

(廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510450)

止咳寶片是由紫菀、橘紅、百部、桔梗、枳殼、陳皮、罌粟殼浸膏等十四味藥材制成的中藥成方制劑，具有宣肺祛痰、止咳平喘的功效[1]，可用于外感風(fēng)寒所致的咳嗽、痰多清稀、咳甚而喘。止咳寶片中主要鎮(zhèn)咳成分為罌粟殼浸膏里的嗎啡，另一主要鎮(zhèn)咳成分為黃酮類物質(zhì)，其中以橘紅、陳皮中的主要化學(xué)成分橙皮苷為代表?，F(xiàn)行《中國藥典》采用高效液相色譜法測定了止咳寶片中的無水嗎啡的含量以控制止咳寶片的含量[1]。而對另一主要鎮(zhèn)咳成分橙皮苷的定量卻無明確規(guī)定，缺乏一定的科學(xué)性。同時可查到的關(guān)于止咳寶片的質(zhì)量控制文獻寥寥無幾。僅有古星妙等[2]等在藥典基礎(chǔ)上優(yōu)化流動相和檢測波長，以此測定止咳寶片中嗎啡的含量。李小燕等[3]采用氮測定法(蒸餾法)，測定止咳寶片中氯化銨的含量。但是，止咳寶片中有關(guān)橙皮苷的含量測定尚仍未見文獻報道。因此，本研究擬建立一種準(zhǔn)確、簡便快速的定量分析方法來控制止咳寶片中橙皮苷的含量，以進一步提高和完善止咳寶片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

儀器:安捷倫1260高效液相色譜儀，XHDZF-系列真空干燥箱(上海霄漢實業(yè)發(fā)展有限公司)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，F(xiàn)A1104A萬分之一電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，KQ5200超聲提取器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試劑: 止咳寶片3批，廣東臺城制藥股份有限公司，批號為20160404，20160937，20161033；橙皮苷對照品(批號110721-201316)，中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，購自德國默克股份有限公司；無水乙醇(分析純)，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)，均購自廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對照品27.2mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(橙皮苷濃度為272μg·mL-1)。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品除去包衣，研細(xì)，取約0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照液的制備

取處方組成中除橘紅、枳殼、陳皮外的其余成分制成不含橘紅、枳殼、陳皮的陰性對照品，按“2.1.2”項下的制備方法處理得陰性対照液。

2.2 色譜條件

Diamond-C18(150mm×4.6mm,2.7μm)色譜柱，流動相∶乙腈-水(21∶79)，檢測波長為283nm；流速1.0mL·min-1；柱溫35℃；進樣量5μL。取對照品溶液(橙皮苷濃度為21.76μg·mL-1)、供試品溶液、陰性對照溶液，分別進樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。理論塔板數(shù)按橙皮苷計應(yīng)不低于2000；保留時間為7.202min；與相鄰峰的分離度大于1.5；拖尾因子為1.05；陰性對照樣品對供試液溶液檢測無干擾，說明該方法專屬性強。

A.樣品(Sample);B.對照(Standard);C.陰性(Negative)圖1 對照品、樣品及陰性的高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別吸取0.1，0.3，0.4，0.5，0.7，1.0mL的橙皮苷對照品儲備液，置5mL量瓶中，加甲醇稀釋成橙皮苷濃度為5.44、16.32、21.76、27.20、38.08、54.40μg·mL-1的溶液。依次進樣10μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積(A)為對照品溶液系列濃度(C)進行回歸，得橙皮苷回歸方程A=9.0463C-7.7933，相關(guān)系數(shù)r=0.9990.表明橙皮苷濃度在5.44～54.40μg·mL-1之間與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。

表1 橙皮苷的線性與范圍

2.4.2 檢測限與定量限

取“2.1.1”配置的橙皮苷對照品溶液，逐級稀釋，檢測限是以信噪比(S/N)時各對照品進樣質(zhì)量濃度，定量限是以信噪比(S/N)為10時對照品進樣質(zhì)量濃度。結(jié)果橙皮苷的檢測限、定量限分別為0.0816μg·mL-11、0.272μg·mL-1。

2.4.3 精密度實驗

取“2.4.1”配制的系列濃度的中間濃度(橙皮苷濃度為21.76μg·mL-1)，按照“2.2”項下的方法連續(xù)進樣5次，記錄橙皮苷峰面積。結(jié)果，橙皮苷峰面積的平均值為192.1，RSD為0.26%，表明儀器精密度良好(見表2)。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液(批號：20161033)在0，2，4，6，8，12h分別進樣5?l，記錄峰面積，結(jié)果橙皮苷峰面積的平均值為191.2，RSD為0.38%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

2.4.5 重復(fù)性實驗

取同一批號(批號：20161033)樣品6份，按“2.1.2”方法提取、測定，結(jié)果橙皮苷平均質(zhì)量濃度為2.757mg·g-1，RSD為1.9%。表明分析方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表4。

2.4.5 加樣回收實驗

精密稱取同一批號樣品(批號：20161033)共6份，加入相應(yīng)量的橙皮苷對照品，照“2.1.2”方法處理并按“2.2”項下測定，計算回收率，結(jié)果見表5。橙皮苷平均回收率為102.6%，RSD=1.5%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品測定

取3批樣品(批號：20160404；20160937；20161033)，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下方法進行測定，結(jié)果見表6。

表6 樣品測定結(jié)果(mg·g-1，n≥3)

3 討論

3.1 提取條件

本實驗考察了分別以甲醇，乙醇為溶劑時對待測成分含量測定提取的影響，從結(jié)果看出以乙醇為溶劑時提取率較高，同時考察了不同濃度的乙醇(50%、70%)的影響，從結(jié)果看出70%乙醇作溶劑時提取率更高。同時，本實驗還考察了超聲30min、回流30min兩種不同提取方式，結(jié)果顯示該兩種提取方式的提取效果基本一致，且考慮到超聲提取方法具有明顯的簡潔性，所以采用超聲法進行提取。另外，實驗還考察了超聲15、30、45min時待測成分含量的變化，結(jié)果表明30min的提取效果較好。故選擇提取條件為70%乙醇超聲提取30min。

3.2 色譜條件

經(jīng)過文獻查閱和參考[4-6]，本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水流動相體系，結(jié)果顯示采用甲醇-水體系時柱壓太大且峰的保留時間過長，色譜峰面積減少，為了延長色譜柱使用壽命及改善色譜條件以更好地分離橙皮苷，加上乙腈的洗脫能力大于甲醇，且甲醇的分離效果一般，故采取乙腈作為流動相。而采取乙腈-0.1%磷酸水比例時雜質(zhì)峰太多，間接造成待測組分色譜峰與相鄰雜峰不完全分開。而乙腈-水體系能夠?qū)⒋郎y組分與雜質(zhì)峰分開得較為令人滿意，在保證符合標(biāo)準(zhǔn)的情況下，乙腈-水的效果好于乙腈-0.1%磷酸水。本實驗還考察了流動相中不同濃度的乙腈(20%、21%)，結(jié)果顯示采用21%乙腈-水系統(tǒng)的待測組分色譜峰與雜質(zhì)峰分離度最好，柱效高，故流動相確定為21%乙腈-水系統(tǒng)。通過二極管陣列檢測器200～400nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)橙皮苷的最大吸收波長為283nm，為提高靈敏度，檢測波長選擇283nm。本實驗還考察了柱溫的選擇(30,35,40℃)，結(jié)果表明柱溫30℃時提取率較低，柱溫40℃時峰寬太大，而柱溫為35℃時組分色譜峰與相鄰雜峰分離度最好，因此柱溫選擇35℃。故，本次實驗的色譜條件是流動相為21%乙腈-79%水系統(tǒng)，柱溫為40℃，檢測波長為283nm。

3.3 小結(jié)

由橙皮苷的測定結(jié)果可知，RSD不大于2%，說明結(jié)果準(zhǔn)確。三批止咳寶片中橙皮苷的含量分別為2.854,3.318,2.757 mg·g-1，說明三批止咳寶片樣品含量相差不大，說明該廠商制劑工藝較成熟，生產(chǎn)該制劑的質(zhì)量比較穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本實驗利用高效液相色譜法測定止咳寶片中橙皮苷的含量，方法簡單、快捷，可為進步一完善止咳寶片的質(zhì)量控制提供重要的依據(jù)。