梁 亮,賈蒙綱,金 偉,曹穎穎,唐海波*,冷 靜*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200； 2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530200)

樹(shù)鼩(tree shrew,Tupaia belangeri)是樹(shù)鼩科樹(shù)鼩屬動(dòng)物,為哺乳動(dòng)物,主要生活在熱帶、亞熱帶地區(qū),是一種具有良好潛力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 樹(shù)鼩作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在特定藥物研發(fā)中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì),從解剖學(xué)分析,樹(shù)鼩的免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的組織形態(tài)特征與靈長(zhǎng)類(lèi)有很高的相似度[1]。 樹(shù)鼩全基因組與多個(gè)物種基因組比較分析證實(shí)了樹(shù)鼩與靈長(zhǎng)類(lèi)親緣關(guān)系最為接近。 此外樹(shù)鼩與人類(lèi)在生理機(jī)能、生化代謝和基因組等方面的相似性遠(yuǎn)高于大鼠、小鼠、土撥鼠等常用嚙齒類(lèi)動(dòng)物。 樹(shù)鼩的許多分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似人類(lèi),同時(shí)樹(shù)鼩個(gè)體小,易于操作,價(jià)格相對(duì)便宜等優(yōu)點(diǎn),性成熟時(shí)間比較短,飼養(yǎng)方法簡(jiǎn)單且繁殖較快[2]。 因此樹(shù)鼩有望代替靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物作為某些人類(lèi)重大疾病研究的動(dòng)物模型,具有廣泛的應(yīng)用前景[3-7]。

樹(shù)鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物,我國(guó)樹(shù)鼩分布于中國(guó)南部和西南部,統(tǒng)屬于中緬樹(shù)鼩(Tupaia belangeri chioensis),具有6 個(gè)亞種。 滇西亞種(T. b. chinensis),也就是目前我國(guó)研究最廣泛最多的一個(gè)種類(lèi),分布于云南西部、中部和南部以及四川西南部。 其他的樹(shù)鼩還包括高黎貢山亞種(T.b. gaoligongensis)、海南亞種(T. b. modesta)、越北亞種(T. b.toninia)、滇南亞種(T. b. yunalis)和瑤山亞種(廣西西北部)( T. b. yaoshanensis)[8]。

廣西瑤山亞種樹(shù)鼩是廣西的一個(gè)特色的物種資源,具有重要開(kāi)發(fā)潛力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,主要分布在廣西金秀等地。 瑤山亞種樹(shù)鼩與中緬樹(shù)鼩其他亞種的外形有較大的差異,其體型是我國(guó)6 種中緬樹(shù)鼩亞種中最大的,成年體重為150～250 g,體長(zhǎng)14.0～19.5 cm。 并且其生物學(xué)特性如乳酸脫氫酶(LDH)同功酶等與其他亞種存在較大的差異[9],在其飼養(yǎng)和繁殖等方面,仍有許多問(wèn)題未解決,樹(shù)鼩對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高,消化道傳染病多,致死率較高,且其繁殖的數(shù)量較低。 關(guān)于廣西瑤山亞種樹(shù)鼩的飼養(yǎng)、疾病等的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少,對(duì)野生瑤山亞種樹(shù)鼩腸道細(xì)菌的種群分布情況,攜帶致病菌資料處于空白狀態(tài)。 因此我們開(kāi)展了瑤山亞種樹(shù)鼩糞便可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定,了解野外捕獲的野生瑤山亞種樹(shù)鼩糞便菌群的多樣性和潛在的致病性,為瑤山亞種樹(shù)鼩的隔離檢疫、實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)及常見(jiàn)消化道疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生瑤山亞種樹(shù)鼩來(lái)自廣西金秀瑤族自治縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心用捕鼠籠捕獲的當(dāng)?shù)厣忠吧恢苣曜笥医】惮幧絹喎N樹(shù)鼩,公母隨機(jī),毛色光亮,體型勻稱(chēng),體重在131～248 g 之間,共19 只成年瑤山亞種樹(shù)鼩。 運(yùn)送至廣西中醫(yī)藥大學(xué)人工馴化養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(桂)2019-0001],經(jīng)由廣西倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)(GXIRB 2018-0006),動(dòng)物使用遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

超凈工作臺(tái)(型號(hào):SW-CJ-2FD)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱(型號(hào):LRH-150F)購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TIANGEN 細(xì)菌總DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；SS 培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)、瓊脂粉等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；常用藥敏試紙:慶大霉素(10 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、復(fù)方新諾明(30 μg)頭孢挫林(30 μg)、頭孢西叮(30 μg)、頭孢他啶(30 μg)、紅霉素(15 μg)、青霉素(10 U)、氨芐西林(10 μg)購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司,其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集及處理

所有糞便標(biāo)本采集及處理相關(guān)設(shè)施均高壓滅菌處理后,分別用滅菌的鑷子采集19 只新捕獲的野生瑤山亞種樹(shù)鼩喂食后4 h 的新鮮糞便,每一只樹(shù)鼩的糞便單獨(dú)編號(hào),并分成兩份,一份取豌豆粒大小至10 mL 滅菌的離心管中,加醫(yī)用生理鹽水5 mL,震蕩混勻后再低速離心1 min,取上清,置-80℃或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),一份直接置-80℃。

1.3.2 細(xì)菌的初步分離

將每份糞便上清分別在麥康凱(MAC)培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線(xiàn),置于生化培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)24～48 h。 根據(jù)培養(yǎng)后菌落形態(tài)、顏色及溶血等特性,初步排除鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,挑取除大腸桿菌外的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落,并進(jìn)行重復(fù)劃線(xiàn)純化培養(yǎng),直到菌落的形態(tài)特征一致。 并挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及純化,最后接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng),4℃冰箱保存?zhèn)溆没?0%的甘油保存至-80℃。

1.3.3 細(xì)菌的革蘭染色

對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行革蘭染色并在油鏡下進(jìn)行鏡檢,記錄所以菌株革蘭染色結(jié)果和細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.3.4 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

用TIANGEN 細(xì)菌總DNA 提取試劑盒提取分離細(xì)菌的總DNA。 采用16S rRNA 通用引物27F/1429R,以細(xì)菌總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并送上海生物工程有限公司測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果在NCBI 上BLAST 比對(duì),并鑒定細(xì)菌的種類(lèi)。 將分離致病菌16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)核酸序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析,并應(yīng)用MEGA 7.0[10]軟件中Maximum likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.3.5 細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)方法(紙片擴(kuò)散法)

將在試管里培養(yǎng)好的細(xì)菌通過(guò)移液槍吸取100 μL 轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,立刻用三角形無(wú)菌推棒涂布之后,將藥敏試紙貼于培養(yǎng)基表面并輕輕按壓使之貼緊呈三角形,室溫放置15 min 后入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 分別貼上相應(yīng)的藥敏試紙。 在37℃下培養(yǎng)24 h 后,觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈大小(mm)。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA 序列分析結(jié)果

圖1 野生瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后檢出情況Figure 1 Detection of bacteria isolated from the feces of wild T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

排除初步鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,剩下的細(xì)菌經(jīng)過(guò)16 s rRNA 序列分析,從19 只樹(shù)鼩中分離鑒定得到7 科13 屬20 種共35 株細(xì)菌(見(jiàn)圖1、表1)。 包括腸桿菌科、細(xì)球菌科、氣單胞菌科、球桿菌科、芽孢桿菌科、假單胞菌科、微桿菌科共7 科的相關(guān)細(xì)菌。 檢出率最高的為腸桿菌科細(xì)菌占68.57%,其中大腸埃希氏菌31.58%(6/19)和弗氏檸檬酸桿菌26.32%(5/19)的檢出率最高。 其次為奇異變形桿菌、氣單胞菌屬、松鼠葡萄球菌等；其他檢查的細(xì)菌包括假單胞菌屬、雷氏普羅威登斯菌、氣單胞菌屬、溶血葡萄球菌等。 先前的報(bào)道包括弗氏檸檬酸桿菌[11-12]、奇異變形桿菌[13]、氣單胞菌屬[14]、松鼠葡萄球菌[15]、假單胞菌屬[16]、雷氏普羅威登斯菌[17]等都可能成為條件性致病菌,同時(shí)也可能造成人畜共患性感染。 這些優(yōu)勢(shì)菌種的檢出,這為廣西野生瑤山亞種樹(shù)鼩糞便菌群的多樣性和潛在的致病性提供了第一手資料,為瑤山亞種樹(shù)鼩的隔離檢疫及實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、常見(jiàn)消化道疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后細(xì)菌遺傳進(jìn)化樹(shù)

排除初步鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,剩下的細(xì)菌根據(jù)16S rRNA 測(cè)序結(jié)果,運(yùn)用MEGA 7.0 軟件Maximum likelihood 的方法建立細(xì)菌的種系遺傳進(jìn)化樹(shù),確定35 株細(xì)菌在分子生物學(xué)分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系(圖2)。 所有的細(xì)菌大體分為7 個(gè)分支,有細(xì)菌的分科大體一致,相關(guān)細(xì)菌或多或少都有一定的親緣關(guān)系,說(shuō)明物種腸道菌群的分布或許跟該物種進(jìn)化有一定的關(guān)系。

2.3 瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離的細(xì)菌常見(jiàn)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)。

為了了解瑤山亞種樹(shù)鼩腸道細(xì)菌對(duì)藥物的敏感與耐藥情況,本研究對(duì)分離得到的部分腸道細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn),常見(jiàn)藥物對(duì)瑤山亞種樹(shù)鼩腸道陰性菌敏感多,陽(yáng)性菌耐藥多。 瑤山亞種樹(shù)鼩腸道分離細(xì)菌對(duì)頭孢唑啉藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐藥率為59%,中介占17%,敏感占24%；頭孢西丁,耐藥率為38%,中介占3%,敏感占59%；頭孢他啶,耐藥占28%,中介占3%,敏感占69%。 紅霉素、氨芐西林及復(fù)方新諾明對(duì)瑤山亞種樹(shù)鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,耐藥率均大于敏感率；青霉素對(duì)瑤山亞種樹(shù)鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,耐藥率等于敏感率；慶大霉素及左氧氟沙星對(duì)瑤山亞種樹(shù)鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,敏感率均大于耐藥率(具體見(jiàn)表2)。今后瑤山亞種樹(shù)鼩發(fā)生消化道相關(guān)疾病時(shí),建議可采用如慶大霉素、左氧氟沙星及頭孢他啶類(lèi)抗生素治療。

表1 瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后16S rRNA 序列分析結(jié)果Table 1 The results of 16S rRNA sequence analysis of bacteria isolated from the feces of T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

3 討論

野生瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后,細(xì)菌經(jīng)16S rRNA 序列分析,共鑒定出7 科13 屬20 種共35 株可培養(yǎng)細(xì)菌,其中腸桿科7屬24 株細(xì)菌分別為:克呂沃爾氏菌屬,腸桿菌屬、泛菌屬、枸櫞酸桿菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬、普羅維登斯菌屬。 據(jù)報(bào)道[18]變形桿菌是引起樹(shù)鼩腹瀉和死亡的常見(jiàn)菌。

高家紅等[19]關(guān)于樹(shù)鼩正常腸道細(xì)菌的研究顯示,大腸桿菌、葡萄球菌菌群及鏈球菌菌群的檢出率較高,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。 可能前者其結(jié)果主要是分離鑒定正常腸道細(xì)菌,與本文采用的分離與鑒定的野生的瑤山亞種樹(shù)鼩糞便細(xì)菌有一定的差異,此外也可能跟樹(shù)鼩的種類(lèi)、馴化程度、飼料及環(huán)境有關(guān),所以掌握野生瑤山亞種樹(shù)鼩腸道細(xì)菌種類(lèi)及多樣性的情況,為本馴養(yǎng)中心今后相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自于廣西野生瑤山亞種樹(shù)鼩,受環(huán)境和地理因素等影響導(dǎo)致樹(shù)鼩體內(nèi)腸道菌群有一定差異,同時(shí)樹(shù)鼩檢測(cè)數(shù)量還不是很多,今后應(yīng)進(jìn)一步增加檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩數(shù)量,在不同時(shí)間再次進(jìn)行培養(yǎng)。 下一步將深入開(kāi)展瑤山亞種樹(shù)鼩馴化過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),特別是通過(guò)檢測(cè)糞便中細(xì)菌的變化情況,了解瑤山亞種樹(shù)鼩在馴化過(guò)程中不同部位菌群在種群分布、數(shù)量的變化。 以期找出瑤山亞種樹(shù)鼩的優(yōu)勢(shì)菌群及與疾病相關(guān)的生物物種標(biāo)記。 同時(shí)對(duì)引起瑤山亞種樹(shù)鼩內(nèi)源性與外源性感染的微生物的研究,初步建立瑤山亞種樹(shù)鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制體系,為今后建立相應(yīng)的瑤山亞種樹(shù)鼩病原微生物檢測(cè)地方標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

表2 樹(shù)鼩腸道細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sensitivity experiment results of intestinal bacteria of the tree shrew to common antibiotics

通過(guò)頭孢類(lèi)藥物對(duì)瑤山亞種樹(shù)鼩腸道細(xì)菌敏感性分析,發(fā)現(xiàn)頭孢唑啉耐藥率最高、頭孢西丁次之、頭孢他啶對(duì)細(xì)菌的敏感程度最高。 這與頭孢類(lèi)抗菌素的抗菌原理和使用頻率相符合。頭孢唑林是一代頭孢類(lèi)藥物、頭孢西丁是二代頭孢類(lèi)藥物、頭孢他啶為三代頭孢類(lèi)藥物。 一代頭孢對(duì)大腸埃希菌、變形桿菌等腸桿菌普遍有抑制作用,而本研究發(fā)現(xiàn)有1 株大腸桿菌、1 株弗氏檸檬酸桿菌、1 株變形桿菌對(duì)頭孢西丁耐藥。 耐藥的機(jī)制和原因未明,這將是將來(lái)我們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一。 頭孢類(lèi)藥物對(duì)腸球菌沒(méi)有作用這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)論相符,因此在實(shí)際工作中更應(yīng)該注意根據(jù)細(xì)菌類(lèi)型選用適合的抗菌藥物來(lái)治療感染。

針對(duì)革蘭陽(yáng)性的球菌和桿菌,本研究進(jìn)一步選用了紅霉素、青霉素和氨芐西林進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明腸球菌對(duì)這三種藥物的耐藥率高,紅霉素、氨芐西林尤為明顯,達(dá)到83%,青霉素次之。 說(shuō)明腸球菌易產(chǎn)生耐藥性。

針對(duì)革蘭陰性菌,本研究進(jìn)一步選用了慶大霉素、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明三種藥物進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明瑤山亞種樹(shù)鼩腸道陰性菌對(duì)慶大霉素和左氧氟沙星敏感,而對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)92%。 而對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星普遍敏感。 大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、腸球菌均是腸道的長(zhǎng)居菌,而菌群的耐藥性改變有可能是引起內(nèi)源性感染的原因之一。 通過(guò)本研究表明,瑤山亞種樹(shù)鼩腸道細(xì)菌對(duì)頭孢唑林、頭孢西丁、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明均存在不同程度的耐藥的菌株,而對(duì)左氧氟沙星、慶大霉素和青霉素的耐藥菌較少。 這提示我們?cè)谶M(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物監(jiān)測(cè)的時(shí)候,不僅僅要關(guān)注野生瑤山亞種樹(shù)鼩引起人畜共患病的病原體的感染情況,也應(yīng)該重視一些長(zhǎng)居菌群在種類(lèi)、耐藥性變異情況的監(jiān)測(cè)。

廣西野生瑤山亞種樹(shù)鼩糞便分離鑒定的菌落,經(jīng)16S rRNA 序列分析,共鑒定出7 科13 屬20 種細(xì)菌,包括豚鼠氣單胞菌、假單胞菌、雷氏普羅威登斯菌、弗氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌、費(fèi)革森埃希菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、普通變形桿菌、羽狀變形桿菌、普羅威登斯菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌等多種常見(jiàn)致病或條件性致病菌。 在樹(shù)鼩特別是瑤山亞種樹(shù)鼩消化道,這些潛在的病原細(xì)菌絕大多數(shù)都是首次報(bào)道,本研究為野生瑤山亞種樹(shù)鼩的馴養(yǎng)及相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。