孫理華,王 娟,張 岳,張 穎,幸世峰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,烏魯木齊 830011)

缺血性心臟病(ischaemic heart disease,IHD)是世界上死亡的主要原因之一[1]。 及時再灌注是IHD的主要治療手段,不僅可以減少梗死面積,而且可以提高IHD 患者的生存率[2]。 再灌注也可能導(dǎo)致梗塞擴展,這是心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)的主要組成部分之一[3]。 MSCs 是一種多能祖細胞,它可以通過多種機制改善動物IHD 模型和IHD 患者的心臟功能,然而,移植的MSCs 在宿主組織中的存活率很低,并且在目標(biāo)組織中僅能檢測一小部分移植的MSCs[4-5]。 多項研究表明,MSCs-Exos 在心肌梗死和MI/RI 后具有心肌保護作用[6-8],而MSCs-Exos中的miRNA 可能為參與心臟保護中的關(guān)鍵因素,因此,Exos miRNA 具有為MI/RI 治療提供強有力的治療靶標(biāo)的潛力。 文獻檢索顯示,MSCs-Exos 中存在幾種高度表達的miRNA,其中,miR-21-5p 是眾所周知的抗凋亡miRNA,它在MSCs-Exos 中高度表達[9]。 研究表明,自噬可能保護缺血性心臟病心肌缺血再灌注損傷[10-11],但尚不清楚MSCs-Exos 是否通過miR-21-5p 調(diào)節(jié)MI/RI 模型中的自噬,從而達到保護心肌的作用。 因此,我們假設(shè)miR-21-5p 可能具有下調(diào)與細胞死亡/存活相關(guān)的特定靶基因的能力,本研究旨在觀察MSCs-Exos 在H2O2誘導(dǎo)的缺氧H9C2 細胞(H9C2s)中及在大鼠MI/RI 模型體內(nèi)是如何調(diào)節(jié)心肌的自噬。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年健康雄性SPF 級別SD 大鼠40 只(4 ～10周齡,250 ～300 g),購自上海Slac 實驗室動物有限公司[SCXK(滬)2018-117]； 動物飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)[SYXK(滬)2016-073],經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會審查(2018049907),對于實驗動物實行3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

H9C2 細胞系購自上海生物科學(xué)研究所；含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/Hi 培養(yǎng)基(北京沃比森科技有限公司,批號:C0662-857)；PKH26(美國Sigma 公司,批號:031224)；H2O2(美國Sigma 公司, 批號:7722-84-1)；CCK-8 溶液(日本DOJINDO 公司,批號:EJ744)；V-PE/7-AAD(美國eBioscience 公司,批號:XY-1944)；GFP-LC3(美國Addgene 公司,批號:KL-Zl-2078)；TUNEL 試劑(瑞士Roche 公司)；TRIzol 試劑盒(日本TOYOBO公司,批號: FSQ-201)；SeraMirTMEVs RNA 提取試劑盒(美國System Biosciences 公司,批號:15596-026)；SYBR Green Master Mix 試劑盒(美國Thermo Scientific 公 司, 批 號: 75762500RX)； Exoquick exosome 快速提取試劑盒(美國Invitrogen 公司,型號:EXOQ5A-1)；透射電子顯微鏡(TEM, 日本Hitachi 公司,型號:HT7700)；qNano 平臺(新西蘭Izon Science 公司)；DAPI 試劑盒(美國Sigma 公司,批號:28718-90-3)；FlowJo 軟件(美國Tree Star 公司)；Olympus FV1000 激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus 公司)；PCR 系統(tǒng)(美國Thermo Scientific 公司)；胎牛血清FBS、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國美國Gibco 公司)；流式細胞儀(FCM,美國BD Biosciences 公司,批號:0796-2007)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs 的分離和培養(yǎng)

采用戊巴比妥(50 mg/kg,腹膜內(nèi)注射)麻醉大鼠,頸脫位處死大鼠。 然后在無菌條件下去除脛骨和股骨。 切開骨頭末端,并用含有1%～2% FBS 的PBS 沖洗骨髓。 然后將細胞懸液通過40 μm 濾網(wǎng)(美國BD Falcon 公司,批號:352340)過濾。 將過濾后的懸浮液以1000 r/min 的速度離心5 min 后,將骨髓細胞放在含有10% FBS 和1%青霉素-鏈霉的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 在第5 天更換培養(yǎng)基以除去非貼壁細胞,并在兩天后進行細胞傳代。 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA 傳代MSCs,并通過流式細胞儀(FCM)進行鑒定,后續(xù)實驗使用第三代MSC細胞。

1.3.2 MSCs-Exos 提取、鑒定及進入H9C2 細胞的內(nèi)在化

將MSCs 接種在10 cm 的培養(yǎng)皿中過夜,待細胞融合度達到80%,使用Exoquick exosome 快速提取試劑盒從細胞中提取MSCs-Exos,提取操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。 使用透射電子顯微鏡評估MSCs-Exos 的形態(tài)。 使用qNano 平臺分析MSCs-Exos 的大小和濃度。 采用Western blot 檢測了MSCs-Exos 的LAMP-1、CD9 和TSG101 蛋白質(zhì)標(biāo)記物的表達水平。

將MSCs-Exos 在37℃的黑暗環(huán)境中用PKH26標(biāo)記15 min,隨后用PBS 中洗滌3 次,并于4℃下,以30000 r/min離心2 h。 然后,將標(biāo)記的Exos(10 μg/mL)置于含H9C2 細胞的培養(yǎng)皿中分別共孵育12 h、24 h。 用PBS 洗滌H9C2 細胞一次,用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS 進行細胞核染色5 min。 使用熒光顯微鏡觀察H9C2 細胞攝取MSCs-Exos 情況。

1.3.3 MSCs 轉(zhuǎn)染

為了下調(diào)MSCs-Exos 中miR-21-5p 表達,用miR-21-5p 抑制劑(MSC/simiR-21-5p)及加干擾對照(MSC/scramble)(終濃度為100 nmol/L)處理MSCs。 使用Lipofectamine 2000 提高干擾效率。 轉(zhuǎn)染24 h 后棄去培養(yǎng)基,更換為含10% FBS 的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 如上述方法純化源自MSC/simiR-21-5p 及MSC/scramble 的Exos。

1.3.4 H9C2 細胞活力測定

檢測MSCs-Exos 及miR-21-5p 對H9C2 細胞活力的影響,首先將H9C2 細胞分別與含MSCs-Exos(10 μg/mL)、MSC-Exos simiR-21-5p(10 μg/mL)及MSC/scramble-Exos(10 μg/mL)共培養(yǎng)12 h,對照組采用普通培養(yǎng)基,然后暴露于H2O2(500 μmol/L)12 h；然后,將10 μL CCK-8 溶液加入到細胞中,再孵育4 h 后,使用酶標(biāo)儀(美國BioTek 公司,批號:El-800)于450 nm 下測定光密度(OD)值,計算與對照組的相對值作為細胞存活率或處理細胞的增殖速率。

1.3.5 H9C2 細胞凋亡率測定

通過FCM 檢測膜聯(lián)蛋白V-PE/7-AAD 評估MSCs-Exos 及miR-21-5p 介導(dǎo)的H9C2 細胞凋亡的情況,按照評估Exos 對細胞生存力影響的實驗中所述,實施了類似的實驗組。 在預(yù)定的時間點,收集細胞,用冰冷的PBS 洗滌兩次,將細胞置于7-AADPercp 和Annexin V-PE 的1×Annexin V 結(jié)合緩沖液中孵育15 min。 最后,采用FCM 檢測凋亡并通過FlowJo 軟件進行分析。

1.3.6 自噬體形成的測定

使用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen 公司,批號:13778-075)將GFP-LC3 質(zhì)粒(1 μL/mL)轉(zhuǎn)染到H9C2s 中,然后用10%福爾馬林固定細胞。 采用Western blot 檢測H9C2s 自噬相關(guān)蛋白的表達,在Olympus FV1000 激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到GFP-LC3 熒光,使用活細胞成像監(jiān)測自噬通量。

1.3.7 動物實驗

(1)動物分組與MI/RI 模型建立

將SD 大鼠(n=30)隨機分成五組(n=6),建立大鼠的MI/RI 模型[12]:(1)假手術(shù)組,對未結(jié)扎的大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)進行縫合；(2)MI/RI組,將LAD 結(jié)扎30 min,然后再灌注2 h；(3)MI/RI+ MSCs-Exos 組,在再灌注前5 min,使用30 號針頭的漢密爾頓注射器將溶解于10 μLPBS 中的MSCs-Exos(5 μg)注入可見損傷區(qū)域的前部和外側(cè)；(4)MI/RI + MSC-ExossimiR-21-5p組,在再灌注前5 min,使用30 號針頭的漢密爾頓注射器將溶解于10 μLPBS 中的MSC-ExossimiR-21-5p(5 μg)注入可見損傷區(qū)域的前部和外側(cè)；(5)MI/RI + MSC/scramble-Exos 組,在再灌注前5 min,使用30 號針頭的漢密爾頓注射器將溶解于10 μLPBS 中的 MSC/scramble-Exos(5 μg)注入可見損傷區(qū)域的前部和外側(cè)。

(2)心肌組織學(xué)分析

取心尖附近的心肌組織,用4%多聚甲醛固定48 h,固定后將心肌組織石蠟包埋,切成橫截面(6 μm),用于TUNEL 和免疫組織化學(xué)染色。 采用DAPI 標(biāo)記所有細胞核,將TUNEL 標(biāo)記的細胞核的細胞視為TUNEL 陽性細胞,每個切片中陽性細胞的數(shù)目是6 個視野中陽性細胞的平均值,計算結(jié)果表示為相對于假手術(shù)組獲得的陽性細胞的百分比。按照免疫組織化學(xué)染色方法處理,然后將載玻片干燥,蓋上蓋玻片并在顯微鏡下檢查,分析心肌組織中LC3B 表達情況,相對光密度(ROD)通過Image pro plus 軟件計算為積分光密度(IOD)與測量面積之比。

(3)RT-qPCR 分析

按說明使用TRIzol 試劑提取心肌組織中的總RNA,使用SeraMirTMEVs RNA 提取試劑盒進行MSCs-Exos 總RNA 提取。 使用ReverTra Ace Qpcr RT 試劑盒將每個樣品的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Master Mix 試劑盒在Applied Biosystems 7500 實時PCR 系統(tǒng)中進行RT-qPCR 反應(yīng)。 使用U6 小核仁RNA 基因的表達用作內(nèi)部對照,并使用2-ΔΔCt方法進行基因表達分析。 miR-21-5p 和U6 的引物是由日本Takara 公司設(shè)計并合成。引物序列如下:miR-21-5p,正向:5′-GGCGGTGTA AACATCCTT-3′,反向:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG TCCGAGGTGTCG-3′； U6, 正 向: 5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′,反 向:5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

(4)心臟功能分析

通過超聲心動圖檢查(GE Vivid E9)以確定心臟結(jié)構(gòu)和功能。 在兩個乳頭肌之間的短軸上觀察心臟,并且通過對三個連續(xù)心跳的結(jié)果求平均值,以M 模式獲得每個測量值。 測量LVID 和LVIDd 以確定心臟形態(tài)的結(jié)構(gòu)變化。 分數(shù)縮短率(%FS)的計算公式如下:%FS=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100,其中LVIDd 為舒張期LV 內(nèi)徑,LVIDs 為收縮期LV內(nèi)徑。 超聲心動圖軟件根據(jù)Teicholz 公式自動計算左心室射血分數(shù)(LVEF)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對本研究數(shù)據(jù)進行分析。 計量資料所均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 采用單因素方差分析和LSD 檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。 P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs-Exos 的特征

MSCs-Exos 在TEM 下觀察顯示球形囊泡,呈圓形或典型的杯形(圖1A)。 使用qNano 對MSCs-Exos 大小進行了分析,結(jié)果顯示其總體分布為40 ～160 nm(圖1B)。 Western blot 證實了Exos 標(biāo)記物TSG101、LAMP-1 和CD9 高表達,而鈣內(nèi)毒素蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種特殊的鈣結(jié)合蛋白,在Exos 中很少出現(xiàn)(圖1C)。 H2O2刺激后12 h,大多數(shù)PKH26標(biāo)記的Exos 位于H9C2s 的細胞質(zhì)中(圖1D)。 上述結(jié)果表明,H2O2刺激后,MSCs-Exos 可被內(nèi)化到H9C2s 中。

2.2 MSCs-Exos 增強H2O2 刺激后的H9C2 細胞的活力并減少細胞凋亡和ROS 的產(chǎn)生

H2O2刺激的H9C2s 制備體外細胞缺氧模型[13],從而模擬MI/RI 動物模型。 與H2O2組相比,H2O2+MSCs-Exos 組細胞活力顯著提高(P ＜0.05),ROS 產(chǎn)生和細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05；與 H2O2+ MSCs-Exos 組 相 比, H2O2+ MSCExossimiR-21-5p組細胞活力顯著降低(P＜0.01),ROS產(chǎn)生和細胞凋亡率顯著增加(P ＜0.01)；H2O2+MSC/scramble-Exos 組的治療效果與H2O2+MSCs-Exos 組相似(圖2)。

2.3 MSCs-Exos 增加了H9C2 細胞自噬的水平

Western blot 檢測顯示:與H2O2組相比,H2O2+MSCs-Exos 組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的表達顯著增強(P ＜0.01),p62 的表達顯著降低(P ＜0.01)；與H2O2+MSCs-Exos 組相比,H2O2+MSCExossimiR-21-5p組的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的表達顯著降低(P＜0.05),p62 的表達顯著增強(P＜0.05)；H2O2+MSC/scramble-Exos 組的治療效果與H2O2+MSCs-Exos 組相似(圖3A)。

圖1 MSCs-Exos 的鑒定和表征Note. A, Representative images of MSC-Exos obtained by TEM analysis. B, qNano analysis was performed on MSC-Exos. C, Western blot analysis of TSG101, LAMP-1, CD9, and cadherin expression in SCS-Exos. D, After the co-culture of H9C2s and pkh26-labeled SCS-Exos for 12 and 24 h, fluorescence microscopy was used to detect the internalization of SCS-Exos into H9C2 cell.Figure 1 Identification and characterization of MSC-Exos

自噬通量結(jié)果顯示:與H2O2組比較,H2O2+MSCs-Exos 組細胞中存在的GFP-LC3 點數(shù)增加；而與 H2O2+ MSCs-Exos 組 相 比, H2O2+ MSCExossimiR-21-5p組細胞中存在的GFP-LC3 點數(shù)顯著降低(P＜0.05),如圖3B。

2.4 在MSCs-Exos 中和MI/RI 后心肌組織中miR-21-5p 的表達

RT-qPCR 分析結(jié)果顯示:miR-21-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染可顯著降低MSCs-Exos 中miR-21-5p 的表達(P＜0.01,圖4A)。 在miR-21-5p 抑制劑及其陰性對照治療MI/RI 后,結(jié)果顯示miR-21-5p 抑制劑在心肌組織中顯著降低了miR-21-5p 表達(P ＜0.01,圖4B)。

2.5 MSCs-Exos 誘導(dǎo)的自噬減少了大鼠心肌細胞的凋亡并改善了心臟功能

與其他各組相比,MI/RI + MSCs-Exos 組的LC3B 表達顯著增強(P＜0.01)(圖5A)；心肌細胞凋亡顯著減少(P＜0.01)(圖5B)；分數(shù)縮短率(%FS)和左心室射血分數(shù)(LVEF)均顯著提高(P ＜0.05)(圖5C)。

3 討論

由于忙碌的生活和工作,越來越多的人不注重自己的飲食習(xí)慣,攝入各種高脂肪食物后,其高膽固醇血癥發(fā)生的概率顯著增加,甚至?xí)葑優(yōu)閯用}粥樣硬化,進而引起冠狀動脈狹窄。 當(dāng)冠脈內(nèi)斑塊脫落時,則易發(fā)生心肌梗死、急性心梗等疾病,用藥物干預(yù)、冠狀動脈支架、冠狀動脈搭橋等方法可以挽救患者的生命。 而當(dāng)發(fā)生心肌缺血時,有數(shù)億的心肌細胞發(fā)生急性壞死,以上治療方法并不能促使心肌的修復(fù)和再生。 近年來,干細胞移植成為治療缺血性心臟病的研究熱點之一,間充質(zhì)干細胞具有分化為心肌細胞的能力,具有補償缺血壞死的心肌細胞的作用。 大量研究表明,干細胞分泌的Exos 有多種生物活性,包括修復(fù)心肌、促進血管新生、促進神經(jīng)再生[14-15]。 外泌體中含有mRNA、miRNA 以及各種抗凋亡和促血管生成因子,能誘導(dǎo)成纖維細胞遷移、增殖及膠原合成[16]。 且外泌體能傳遞miRNA至靶細胞,發(fā)揮促進組織再生作用[17]。 而miR-21-5p 具有促進細胞增值和遷移的功能[18]。 心肌I/R損傷病理機制研究的不斷完善,有助于對相關(guān)治療靶點更加深入探索。 I/R 損傷涉及炎癥因子的釋放、氧化應(yīng)激、自由基損傷、自噬及細胞凋亡等病理生理過程[19-20]。 miR-21-5p 可作為糖尿病性心肌病的候選治療靶標(biāo),也是治療腦外傷炎癥的重要探索方向[21-22]。 在MI/RI 期間,主要是從線粒體運輸鏈中產(chǎn)生了過量的ROS,過量的ROS 通過各種機制導(dǎo)致細胞死亡[23]。

圖2 MSCs-Exos 對H9C2 細胞的活力,H2O2 誘導(dǎo)的細胞凋亡和ROS 產(chǎn)生的影響Note. A, Cell viability was assessed by the CCK-8 assay. B, Evaluation of ROS production by fluorescence microscopy. C, The apoptosis of H9C2 cells was detected by FCM. Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Compared with the H2O2 group,##P＜0.01,###P＜0.001.Compared with the H2O2+MSCs-Exos group,&&P＜0.01,&&&P＜0.001.The same as below.Figure 2 Effect of SCS-Exos on H9C2 cell viability, H2O2-induced apoptosis, and ROS production

圖3 MSCs-Exos 對H9C2 細胞自噬水平的影響Note. A, The effect of SCS-Exos on the expression of autophagy markers p62 and LC3 in H9C2 cells. B,H9C2 cells were transfected with a GFP-LC3 plasmid, and LC3 puncta were observed under a confocal fluorescence microscope. The bar graph shows the number of GFP points per cell.Figure 3 Effect of SCS-Exos on the autophagy level in H9C2 cells

圖4 在MSCs-Exos 中和MI/RI 后心肌組織中miR-21-5p 的表達Note. A, miR-21-5p was expressed in MSC exos after transfection with miR-21-5p inhibitor and its negative control. B, Expression of miR-21-5p in the myocardium after MSC exos and miR-21-5p inhibitor treatment (n = 4). Compared with the control group,* P ＜0.05,*** P ＜0.001,#P＜0.05,###P＜0.001.Compared with the MI/RI + MSCs-Exos group,**P＜0.01,&&P＜0.01.Figure 4 Expression of miR-21-5p in the myocardium after MSCs-exos and MI/RI

圖5 miR-21-5p 誘導(dǎo)的自噬對MI/RI 大鼠細胞凋亡和心臟功能。Note. A,Immunohistochemical staining of LC3b in the myocardium of each group. B,TUNEL staining was used to analyze the effect of MSCs-Exos and MSC-ExossimiR-21-5p on the apoptosis of cells after MI/RI. C, Cardiac function was measured by echocardiography. Compared with the control group,*P＜0.05,**P ＜0.01, ***P ＜0.001.Compared with the MI/RI group,*P ＜0.05,**P ＜0.01.Compared with the MI/RI + MSCs-Exos group,& P＜0.05.Figure 5 Autophagy induced by miR-21-5p can enhance apoptosis and cardiac function in MI/RI rats

本研究顯示了H2O2誘導(dǎo)的ROS 降低H9C2 細胞活力并增加細胞凋亡。 暴露于H2O212 h 后,H9C2s 中的自噬通量被阻滯,這與細胞凋亡率顯著增加是一致的,說明缺氧或缺血性損傷后自噬的增強對心肌有保護作用,心肌自噬減少了心肌細胞的凋亡并改善了心肌細胞的存活,心肌細胞自噬的上調(diào)減弱了MI/RI[24-27]。 本研究通過抑制MSCs-Exos中的miR-21-5p 表達,發(fā)現(xiàn)其可顯著逆轉(zhuǎn)MSCs-Exos對自噬、細胞凋亡和心臟功能的作用。 上述結(jié)果表明MSCs-Exos 可能通過miR-21-5p 調(diào)節(jié)自噬保護免受H2O2誘導(dǎo)的H9C2 細胞損傷,同時介導(dǎo)大鼠MI/RI 后的心臟自噬作用,當(dāng)MSCs-Exos 注射入MI/RI大鼠模型時,自噬增加,凋亡減小,心臟功能得到改善。

綜上所述,MSCs-Exos 可保護H2O2誘導(dǎo)的H9C2 細胞凋亡,其可能作用機制為miR-21-5p 參與MSCs-Exos 誘導(dǎo)的心肌自噬來實現(xiàn)保護MI/RI 損傷[28-32]。 這些發(fā)現(xiàn)可能為利用miR-21-5p 在優(yōu)化未來基于干細胞的心臟病治療中的作用開辟新的研究方向。