李筱楠,雍淇文,張 銘,姚文靜,王佳豪,馮 強(qiáng),王 娜*,王俊霞*,崔力劍

(1.石家莊鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院,石家莊 050000； 2.河北醫(yī)科大學(xué),石家莊 050000；3.寧晉縣中西結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 邢臺(tái) 055550； 4.河北中醫(yī)學(xué)院,石家莊 050000)

抑郁癥(major depressive disorder, MDD)是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩和認(rèn)知功能損害為主要臨床癥狀的疾病[1]。 據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì):2005 到2015 十年間,全球抑郁癥患者人數(shù)增長(zhǎng)18.4%,已達(dá)3.22 億。 抑郁癥會(huì)導(dǎo)致患者有自殺、自殘等行為,目前每年約80 萬人因此自殺,同時(shí)抑郁癥也是全球首要致殘因素。 可見抑郁癥已經(jīng)成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[2]。 中國(guó)的抑郁癥患病率為4.2%,屬于高患病率國(guó)家之一[3]。

長(zhǎng)期以來,傳統(tǒng)藥物治療一直是對(duì)抗抑郁癥的重要手段,而中藥抗抑郁效果尤為突出。 根據(jù)一項(xiàng)薈萃分析研究顯示,單獨(dú)采用中藥治療抑郁癥的效果優(yōu)于安慰劑,與化藥相當(dāng),且副作用發(fā)生率比化藥少[4]。

由蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子組成的經(jīng)典方劑越鞠丸,始載于元代著名醫(yī)家朱震亨的《丹溪心法》——“越鞠丸,解諸郁”。 現(xiàn)代臨床和藥理學(xué)研究均表明,越鞠丸具有抗抑郁活性[5]。 有學(xué)者對(duì)越鞠丸依次拆方,將不同中藥藥對(duì)組合,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行抗抑郁作用的篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)梔子—川芎組合為越鞠丸發(fā)揮抗抑郁作用的關(guān)鍵藥對(duì),且川芎能夠提高梔子的抗抑郁效果[6-7],但梔子-川芎藥對(duì)的抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還鮮有報(bào)道。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,對(duì)梔子-川芎抗抑郁的主要功效成分及其作用機(jī)制進(jìn)行探討,以期揭示梔子-川芎在越鞠丸中配伍的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡雄性ICR 小鼠,224 只,體重23 ～25 g,SPF 級(jí),購于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部[SCXK(冀)2018-004],飼養(yǎng)條件:恒溫(23±2)℃,恒濕(60±5)%,光暗周期循環(huán)(12/12 h),分籠飼養(yǎng),自由攝取食物及水,飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與健康研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)[SYXK(冀)2018-0008]。 所涉及的實(shí)驗(yàn)獲得河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NO IACUC-Hebmu-2019004),并根據(jù)3R 原則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及使用給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑

丁基苯酞、Jasminoside J、Gardenal-I、4-methoxylphenethyl-butyl ether、由實(shí)驗(yàn)室自制；鹽酸氟西汀購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 化學(xué)成分的收集與整理

通過Web of Science,CNKI,Sciencedirect 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,收集到梔子中的化學(xué)成分219個(gè),川芎121 個(gè)。 然后采用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制所有化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式,保存為cdx 格式。 再采用OpenBable 2.4.1 將cdx 格式轉(zhuǎn)換為SMILE 格式,備用。

1.3.2 類藥性分析

類藥性是口服中藥成分的重要參數(shù),本文將上述收集得到的梔子-川芎藥對(duì)的化合物導(dǎo)入Swiss ADME,預(yù)測(cè)其吸收性質(zhì),并篩選出符合類藥性五原則的化合物(即Lipinski #violations=0)。

1.3.3 化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將梔子-川芎中符合類藥性五原則的化合物導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.swisstargetprediction.ch/),進(jìn)行化合物的作用靶點(diǎn)分析。 下載包含靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)文件,備用。

1.3.4 梔子-川芎抗抑郁的相關(guān)作用靶點(diǎn)篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.genecards.org/)中檢索與抑郁癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)(relevance score＞150),并將上述靶點(diǎn)與梔子-川芎的化合物作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配,相同的靶點(diǎn)即被認(rèn)為是梔子-川芎抗抑郁活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將梔子-川芎抗抑郁活性成分的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https:/ /string-db.org/),進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,分析結(jié)果保存為TSV 格式文件,保存文件中的node1、node2 和Combined score等信息,然后導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.0 進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,根據(jù)degree 值對(duì)梔子川芎抗抑郁的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.6 梔子-川芎抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)的信號(hào)通路分析

采用Cytoscape Version 3.7.0 軟件中的cluego插件,對(duì)梔子-川芎藥對(duì)的關(guān)鍵抗抑郁作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析,設(shè)定閾值P＜0.05。

1.3.7 梔子-川芎藥對(duì)化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將梔子-川芎抗抑郁的關(guān)鍵靶點(diǎn)、與關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的抗抑郁活性成分以及抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)的信號(hào)通路,導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.0 軟件,構(gòu)建梔子-川芎抗抑郁活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。 在該作用網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分、作用靶點(diǎn)或信號(hào)通路,邊代表活性成分-作用靶點(diǎn)、作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路相連接,若與活性成分相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)在某一信號(hào)通路中,也將該活性成分與該信號(hào)通路以邊相連接。

1.3.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)各采用224 只小鼠,隨機(jī)分為28 組,每組8 只,分別為空白對(duì)照組(蒸餾水),陽性對(duì)照組鹽酸氟西汀(10 mg/kg),丁基苯酞組(10、 30、 90 mg/kg), Gardenal-I 組(50、 100、 200 mg/kg),Jasminoside J 組(10、30、90 mg/kg),4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 組(10、30、90 mg/kg)。依據(jù)文獻(xiàn)[6-7]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物14 d。

1.3.9 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

在第14 天,小鼠灌胃給藥60 min 后,用膠帶將小鼠懸于距地面50 cm 處的尾部,膠帶貼于距尾部1 cm 處。 開始時(shí)小鼠頭部可上下左右擺動(dòng),一段時(shí)間后因失望而使活動(dòng)減少,即出現(xiàn)間斷性不動(dòng)狀態(tài)。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要6 min 完成,記錄最后4 min 內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間。

1.3.10 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

在第14 天,小鼠灌胃給藥60 min 后,將小鼠分別放入一個(gè)直徑為20 cm,高度為50 cm 的圓筒中,圓筒中水的高度為40 cm,水溫為(24±1)℃。 觀察時(shí)間為6 min,記錄后4 min 內(nèi)的累積不動(dòng)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 梔子-川芎活性成分的抗抑郁靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過類藥性分析,梔子和川芎兩種藥材中分別有92 和87 個(gè)化合物符合類藥性五原則的要求,通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)上述兩種藥材的化合物的作用靶點(diǎn)分別有1380 和1433 個(gè),去除重復(fù)后,分別得到293 和329 個(gè)靶點(diǎn)。 通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中的抑郁癥相關(guān)基因進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)分別有23 和19 個(gè)與梔子和川芎治療抑郁癥相關(guān)的作用靶點(diǎn),其中兩種藥材共有的抗抑郁相關(guān)靶點(diǎn)為11 個(gè),詳見表1。

表1 梔子-川芎藥對(duì)潛在的抗抑郁靶點(diǎn)信息Table 1 Information on the protein targets of the active ingredients in Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum and their antidepressant effects

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述31 個(gè)作用靶蛋白導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫,限定物種為人,獲取的蛋白相互作用結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件,構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1。

圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),節(jié)點(diǎn)越大表示degree 值越大,說明其在梔子-川芎抗抑郁過程中就可以發(fā)揮更重要的作用。 在圖1 中,degree 值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)分別為COMT、HTR1A、DRD2、 SLC6A4、 SLC6A3、 MAOA、 GRM5、 DRD4、DRD3、 HTR2A、 HTR3A、 GRIA1、 APP、 HTR1B和GRM1。

2.3 信號(hào)通路分析

利用Cytoscape Version 3.7.0 軟件中的cluego插件進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析。 如圖2 所示,梔子-川芎抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及Serotonergic synapse、Dopaminergic synapse、 Taste transduction、 Gap junction、Long-term potentiation、Cocaine addiction 和Amphetamine addiction 等7 條信號(hào)通路。

2.4 梔子-川芎的抗抑郁活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)分析

將梔子-川芎抗抑郁活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件,構(gòu)建了活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖3。 圖中紅色和黃色分別代表?xiàng)d子和川芎的抗抑郁活性成分,藍(lán)色為抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn),綠色代表信號(hào)通路。 Degree 值是評(píng)價(jià)某節(jié)點(diǎn)在整個(gè)靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中重要性的關(guān)鍵參數(shù)。 本文采用Cytoscape 軟件中的Tools-Analyze Network 插件,計(jì)算出靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)的degree 值。 根據(jù)degree 值,發(fā)現(xiàn)梔子-川芎藥對(duì)的關(guān)鍵活性成分為jaminoside J(Z54)、4-methoxyl-phenethyl-butyl ether(Z8)、butylphthalide(C19,丁基苯酞)、Gardenal-I(Z112)(degree 值均≥7,在梔子-川芎藥對(duì)的活性成分中排名前四),活性成分名稱和結(jié)構(gòu)式見圖4；關(guān)鍵信號(hào)通路為KEGG:04728(Dopaminergic synapse)和KEGG:04726(Serotonergic synapse)(degree 值均≥39)。

圖1 梔子-川芎藥對(duì)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Protein-protein interactions involved in the antidepressant effects of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum

圖2 梔子-川芎抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 信號(hào)通路富集分析Figure 2 KEGG pathway enrichment analysis of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum compounds with antidepressant activity

圖3 梔子-川芎藥對(duì)抗抑郁活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Component-target-pathway network of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum compounds with antidepressant activity

2.5 藥理活性驗(yàn)證

在懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中,與空白組相比,陽性對(duì)照組、丁基苯酞和Gardenal-I 中、高劑量組均能顯著性減少不動(dòng)時(shí)間、4-methoxyl-phenethylbutyl ether 高劑量組能減少不動(dòng)時(shí)間(見表2),進(jìn)一步驗(yàn)證了這幾個(gè)化合物具有一定抗抑郁活性,但jaminoside J 組顯示未能明顯減少不動(dòng)時(shí)間,說明jaminoside J 未顯示出明顯的抗抑郁活性。

抑郁癥是嚴(yán)重影響國(guó)人健康的重大疾病,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),越鞠丸具有明確的抗抑郁效果,而梔子-川芎是越鞠丸中抗抑郁的主要活性藥對(duì)[7-8],其中梔子苦寒,可化郁久之熱,又因其具有解郁除煩之效,因此,丹梔逍遙散、梔子豉湯等多種抗抑郁的經(jīng)典方劑中均配伍有梔子,多項(xiàng)研究報(bào)道也發(fā)現(xiàn)梔子是臨床治療抑郁癥的一味常用中藥[9-10]。 川芎為血中氣藥,上行頭目,下調(diào)經(jīng)水,中開郁結(jié)。 川芎配伍梔子可引其上行頭目,發(fā)揮增加療效之功[11-12],但是兩種配伍的抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還不明確。

3 討論

圖4 梔子-川芎抗抑郁活性成分Figure 4 Components of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum with antidepressant effects

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法,探討梔子-川芎藥對(duì)配伍治療抑郁癥的活性成分、活性靶點(diǎn)及相關(guān)的作用通路。 通過數(shù)據(jù)挖掘找到梔子和川芎的成分共179 個(gè),進(jìn)一步根據(jù)degree 值篩選出梔子-川芎藥對(duì)的關(guān)鍵活性成分為jaminoside J、4-methoxyl-phenethyl-butyl ether、butylphthalide(丁基苯酞)、Gardenal-I,其中丁基苯酞是川芎中重要的活性成分之一,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的多種疾病具有良好的治療作用[13]。 藥理實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明,川芎能改善長(zhǎng)期慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)大鼠的抑郁癥狀[13]。 臨床研究表明,丁基苯酞聯(lián)合化藥(帕羅西汀、氟西汀、曲唑酮等)對(duì)卒中后抑郁的治療效果良好,能夠保護(hù)神經(jīng)功能缺損[14-16]。 Gardenal-I為梔子中環(huán)烯醚萜類結(jié)構(gòu),已有大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明梔子中的環(huán)烯醚萜類結(jié)構(gòu)具有抗抑郁活性[17]。 4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 和jasminoside J 分 別為梔子中簡(jiǎn)單苯丙素類和單萜類結(jié)構(gòu),但目前就這兩種化合物抗抑郁效果鮮有報(bào)道。 本文在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上使用ICR 小鼠進(jìn)行了上述四類化合物抗抑郁活性初步測(cè)試。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁基苯酞和Gardenal-I 中、高劑量組具有顯著抗抑郁活性,4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 高劑量組具有抗抑郁活性,jasminoside J 無抗抑郁活性。 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步預(yù)測(cè),丁基苯酞、Gardenal-I 及4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 可能是越鞠丸抗抑郁的關(guān)鍵性成分,但這并不代表越鞠丸的抗抑郁活性完全是由這幾種成分決定的。 由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法是從“多成分-多靶點(diǎn)”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系中,篩選得到對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)影響最大的成分,在研究過程中,并未能考慮到藥物血藥濃度等問題,所以,本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中,也并未考慮上述幾種單體成分在臨床給藥劑量下能否達(dá)到等問題,這也是該研究方法存在的不足之處。

表2 不同化合物對(duì)懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響(ˉx ± s, n=8)Table 2 The effects of different compounds on forced swimming and tail suspension tests in mice

此外,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)梔子-川芎抗抑郁活性成分主要作用于 Dopaminergic synapse 和Serotonergic synapse 等信號(hào)通路,而前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[18-19]。 很多現(xiàn)代臨床治療抑郁癥的一線化藥也主要針對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的相關(guān)靶點(diǎn),提高體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度以達(dá)到治療抑郁癥的目的[20-22]。

綜上所述,本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,探討了梔子-川芎藥對(duì)的多成分、多靶點(diǎn)與抑郁癥疾病之間的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò),初步探索了梔子-川芎藥對(duì)抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ),為進(jìn)一步研究奠定了一定的基礎(chǔ)。