張廣仁，王南南，彭紀(jì)銘，劉發(fā)貴，劉思光，李鐵建，張貴民

（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 276000）

氯唑沙宗為中樞性肌肉松馳藥，作用于脊髓內(nèi)神經(jīng)肌腱反射多突觸通道而產(chǎn)生肌肉松弛，臨床用于治療各種急、慢性肌肉酸痛、慢性筋膜炎及由中樞神經(jīng)病變引起的肌肉痙攣等癥[1]。氯唑沙宗生產(chǎn)工藝中可能存在水合肼雜質(zhì)，影響產(chǎn)品質(zhì)量[2-9]。本文用丙酮作為衍生化試劑，采用頂空瓶為衍生器，采用恒溫孵化的方式對(duì)藥物中殘留肼進(jìn)行衍生化，分析了氯唑沙宗中水合肼的殘留量[10]。本法樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、省時(shí)，方法靈敏度高、選擇性好，可用于氯唑沙宗質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

Agilent 7890B型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有分流-不分流進(jìn)樣口和通用型FID檢測(cè)器；Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫公司）；氯唑沙宗原料藥（山東新時(shí)代藥業(yè)）；水合肼對(duì)照品（分析純，阿拉?。槐ㄉV純，美國(guó)賽默飛世爾公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度為200 ℃；分流比1:1；檢測(cè)器溫度為300 ℃；載氣為氮?dú)?；流速? ml/min；DBWAX色譜柱（30 m×0.53 mm，0.5 μm），起始柱溫45 ℃，維持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至230 ℃，維持2 min；頂空瓶孵化溫度80 ℃，孵化時(shí)間30 min。

2.2 溶液制備

2.2.1 稀釋液 精密量取冰醋酸1 ml，置1000 ml量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為冰醋酸-丙酮溶液；量取冰醋酸-丙酮溶液100 ml，置1000 ml量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取氯唑沙宗原料藥約2 g，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加入稀釋液溶解并定容至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 取水合肼約0.1 g，精密稱(chēng)定，置10 ml量瓶中，加入稀釋液溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液0.05 ml，置50 ml量瓶中，定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 加標(biāo)供試品溶液 取氯唑沙宗原料藥約2 g，置10 ml量瓶中，加入對(duì)照品溶液溶解并定容至刻度，作為加標(biāo)供試品溶液。

2.3 衍生條件

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的樣品，置頂空瓶中，加入適量稀釋液，密封，80 ℃下孵化30 min，即可衍生完全[7]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性 分別精密量取空白溶劑、對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液各2 ml，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1）。由圖1可見(jiàn)，空白溶劑對(duì)水合肼的檢出無(wú)干擾。

圖1 氯唑沙宗GC圖譜

2.4.2 線(xiàn)性與范圍 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別逐級(jí)稀釋成系列不同濃度的對(duì)照品溶液，分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2 ml，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程為Y=0.132X+0.0135，r=0.9994，表明水合肼在0.507～20.294 μg/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.3 溶液穩(wěn)定性 室溫條件下，分別于0，2，4，6，8，10 h，精密量取對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液各2 ml，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明：對(duì)照品溶液于室溫放置10 h，峰面積RSD為8.0 %；加標(biāo)供試品溶液于室溫放置10 h，峰面積RSD為4.4 %，表明對(duì)照品溶液及測(cè)試溶液于室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 定量限和檢出限 精密量取2.2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 ml，置20 ml量瓶中，加稀釋液溶解至刻度。進(jìn)一步稀釋至不同濃度，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。水合肼的檢出限（S/N=3:1）為0.169 μg/ml，定量限（S/N=10:1）為0.507 μg/ml。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取氯唑沙宗原料藥9份，每份約2 g，分別置入10 ml量瓶中，其中3份加8.125 μg/ml的對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，作為80 %測(cè)試溶液；3份加10.157 μg/ml的對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，作為100 %測(cè)試溶液；3份加12.188 μg/ml的對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，作為120 %測(cè)試溶液，用9份測(cè)試溶液的測(cè)定結(jié)果計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 重復(fù)性和中間精密度 按2.2.4項(xiàng)下方法制備6份同一濃度的加標(biāo)供試品溶液，1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算重復(fù)性，其含量RSD值為3.6 %；按2.2.4項(xiàng)下方法制備6份同一濃度的加標(biāo)供試品溶液，不同分析人員在不同日期、不同儀器上考察中間精密度，其含量RSD值為3.1 %。

2.4.7 耐用性 分別考察了頂空進(jìn)樣器平衡時(shí)間、頂空進(jìn)樣器平衡溫度、進(jìn)樣口溫度、色譜柱流速在一定范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)色譜分離的影響。頂空進(jìn)樣器平衡時(shí)間變化±5 min，頂空進(jìn)樣器平衡溫度變化±5 ℃，進(jìn)樣口溫度變化±5 ℃，色譜柱流速變化±0.1 ml/min，水合肼檢出量的RSD為5.1 %，符合驗(yàn)證要求。

2.5 樣品檢測(cè)

取3批氯唑沙宗，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，頂空進(jìn)樣。結(jié)果3批樣品均未檢出水合肼殘留。

3 討論

3.1 樣品衍生條件選擇

本文選用丙酮為衍生化試劑，以冰乙酸為催化劑，以衍生物含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)分別考察反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，衍生反應(yīng)完全。

3.2 色譜條件的選擇

本文對(duì)比了熱導(dǎo)檢測(cè)器和氫火焰離子化檢測(cè)器對(duì)水合肼的響應(yīng)差異，發(fā)現(xiàn)氫火焰離子化檢測(cè)器靈敏度可滿(mǎn)足分析要求。同時(shí)比較了非極性色譜柱（DB-1）、弱極性色譜柱（TG-624）、強(qiáng)極性色譜柱（DB-WAX）對(duì)水合肼衍生物的選擇性，發(fā)現(xiàn)DB-WAX色譜柱可使水合肼衍生物峰形對(duì)稱(chēng)。

水合肼是強(qiáng)堿性化合物，存在極性大，毒性強(qiáng)，限度低，檢出難度高的問(wèn)題[11-14]。通過(guò)對(duì)水合肼衍生化，可增加水合肼在氫火焰離子化檢測(cè)器上的靈敏度，同時(shí)衍生條件簡(jiǎn)單，無(wú)需轉(zhuǎn)移即可進(jìn)樣分析，提高效率。