劉淑集，許 旻，蘇永昌，廖登遠(yuǎn)，陳曉婷，喬 琨，蔡水淋，潘 南，陳 貝，王 茵，蘇 捷，劉智禹

[福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門)，福建 廈門 361013]

肝損傷是臨床常見的危害人類健康的疾病，主要分為2類，即病理性肝損傷和化學(xué)性肝損傷。其中，化學(xué)性肝損傷是指由某些藥物、環(huán)境中的化學(xué)有毒物質(zhì)或者酒精等對肝臟造成的損害[1]，會引起多種肝臟疾病如肝硬化、肝癌、肝纖維化等[2-3]，以藥物性和酒精性肝損傷最為常見?，F(xiàn)代人因?yàn)轱嬀七^量引起肝損傷的現(xiàn)象越來越普遍，這是因?yàn)檫M(jìn)入人體后、超過95%的酒精是在肝臟中進(jìn)行代謝，并轉(zhuǎn)化成具有高毒性的乙醛而損壞肝臟[4]。目前對肝損傷的防治仍是一個全球性的嚴(yán)峻課題[5]，因而開展天然產(chǎn)物對肝損傷的保護(hù)、預(yù)防或治療的研究具有重要意義。

牡蠣是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，在我國也是四大養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣味道鮮美，富含鋅、?；撬?、蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)成分，具有較高的藥用價值。目前諸多的報道顯示?；撬岷吞窃哂辛己玫慕饩谱o(hù)肝作用[6-7]。楊勇進(jìn)等研究結(jié)果表明牡蠣提取物可以有效地減緩酒精性肝損傷大鼠的interleukin-17(IL-17)、tumor necrosis factor alpha(TNF-α)及轉(zhuǎn)氨酶水平的升高，有明顯的保肝降酶作用[8]。李旭等也研究了牡蠣提取物對小鼠肝臟保護(hù)作用研究，表明牡蠣粉提取物能提高小鼠肝內(nèi)乙醇脫氫酶活性，在護(hù)肝的同時具有一定的解酒作用[9]。淑英等研究結(jié)果表明富鋅牡蠣粉可降低酒精致肝損傷小鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、半乳糖基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Galactosyl glucosyltransferase，GCT)活性及丙二醛(MDA)含量，增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase(SOD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性，對肝損傷具有一定的保護(hù)作用，這可能與其增強(qiáng)抗氧化能力和抑制脂質(zhì)氧化有關(guān)[10]。黃健等研究表明牡蠣能提高小白鼠醉酒耐受時間，縮短醉酒時間，具有一定的預(yù)防醉酒作用，對酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化及改善肝組織病變有關(guān)[11]。因每位研究學(xué)者制備牡蠣提取物的方法不一致，導(dǎo)致所獲得的提取物成分也會有所不同。因此，本文通過50%乙醇建立急性肝損傷模型，擬從血清生化指標(biāo)、肝臟脂肪變性等情況研究實(shí)驗(yàn)室自制的牡蠣提取物對小鼠急性肝損傷的輔助保護(hù)作用，以期為開發(fā)保肝護(hù)肝功效的牡蠣保健食品提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

牡蠣提取物自制，參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行提取制備，將牡蠣肉勻漿，加入2倍水、胰蛋白酶(7 500 U/g)和風(fēng)味蛋白酶(450 U/g)，調(diào)pH 8.0，在50℃條件下酶解5 h，100℃滅酶10 min，冷卻，三層紗布過濾，濾液依次通過陶瓷膜(200目)、截留分子量為5 000 Da和1 000 Da的超濾膜及納濾膜，凍干，獲得牡蠣提取物，其中蛋白質(zhì)含量70.6%、灰分5.5%、脂肪2.8%、水分4.7%，通過凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatography，GPC)測定分子量低于1 000 Da的占93%以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及環(huán)境

SPF級ICR種雄性小鼠50只，體重18～22 g，每組10只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2016-0002。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(湘)2015-0012。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為屏障環(huán)境，溫度為22～25℃，濕度為46%～48%。

1.3 主要儀器與試劑

722S分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、組織勻漿器、混懸器、加樣器、BECKMAN COULTER AU680全自動生化分析儀。

還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物處理

設(shè)定牡蠣提取物的劑量為0.375、0.750、2.250 g/kg?bw(分別相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、30倍)，分別為低、中、高劑量組，同時設(shè)定正常組和肝損傷模型組，每組10只。分別稱取牡蠣提取物3.75、7.50、22.50 g，并分別加蒸餾水至200 mL進(jìn)行溶解，每天對小鼠灌胃1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g?bw，連續(xù)30 d，正常組和肝損傷模型組給予等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠每兩周稱重一次，并記錄數(shù)據(jù)。第30天，對各劑量組和模型組給予50%乙醇(12 mL/kg)灌胃，造成急性肝損傷模型，正常組給予蒸餾水灌胃，禁食16 h處死動物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測及病理組織學(xué)檢查。

1.4.2 指標(biāo)檢測

取肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，檢測肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量，按照南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進(jìn)行測定。

1.4.3 病理組織學(xué)檢查

從小鼠肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹紅染色。鏡檢時從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個組織切片，觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積，并按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：0分，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在、稀少；1分，含脂滴的干細(xì)胞不超過1/4； 2分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/2；3分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/4；4分，肝細(xì)胞幾乎被脂滴代替。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果都以平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用One way-ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

1.6 結(jié)果判定

肝組織中MDA、GSH、TG三項(xiàng)檢測指標(biāo)結(jié)果陽性，或肝組織中MDA、GSH、TG三項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽性和病理檢測結(jié)果陽性，均可判定受試樣品對化學(xué)性肝損傷具有輔助保護(hù)功效。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣提取物對動物體重的影響

小鼠灌胃牡蠣提取物30 d期間，對各組小鼠的體重進(jìn)行監(jiān)測，觀察小鼠體重增重情況，結(jié)果如表1所示。各劑量組小鼠體重經(jīng)飼喂30 d 后，體重均增加了18～20 g；與空白組相比，模型組的體重增加量有稍微少一些，但是差異沒有顯著性(P>0.05)。各劑量組小鼠的體重增加量呈遞增趨勢，但是各組之間也無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 牡蠣提取物對肝組織中MDA、GSH、TG含量的影響

由圖1、圖2可知，模型組的MDA、TG水平均極顯著高于空白組(P<0.01)，分別是空白組的1.77、1.49倍，而模型組的GHS水平極顯著低于空白組(P<0.01)，僅為空白組的63.8%。牡蠣提取物各劑量組能夠抑制MDA的升高，且隨著劑量的增加，抑制效果更顯著，其中高劑量組的MDA水平降到模型組的64.8%，接近空白組的水平。各劑量組的牡蠣提取物能夠提高GSH水平，且呈劑量效應(yīng)，高劑量組的GSH水平比模型組提高了0.49倍。隨著牡蠣提取物劑量的增加，TG水平逐漸降低，高劑量組的TG水平明顯降低到模型組的72.5%，有差異顯著性(P<0.05)。

2.3 牡蠣提取物對肝組織病理的影響

小鼠飼喂30 d后，觀察了小鼠的肝組織脂肪變性程度，結(jié)果如表2所示。模型組肝臟脂肪變性的程度是空白組的10.33倍，差異極顯著(P<0.01)；牡蠣提取物各劑量組肝臟脂肪變性程度有稍微緩解，且劑量越大，緩解程度越大；高劑量組的肝臟脂肪變性程度降低到模型組的61.0%，說明牡蠣提取物可以修復(fù)由酒精刺激引起的肝臟脂肪變性。

表2 牡蠣提取物對小鼠肝臟組織脂肪變性的程度的影響

注：Δ與正常組相比，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01；*與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1、圖2同此。

Note：ΔCompared to normal group，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01；*Compared to model group，*P< 0.05，**P< 0.01.The same as Fig.1 and Fig.2.

3 討論

由于我國的飲食文化豐富，其中酒桌文化在增進(jìn)人們之間感情的同時，也深深影響著人們的身體健康。目前，我國酒精性肝病的發(fā)病率高達(dá)20%[13]，因此，對于酒精肝的預(yù)防與治療已成為人們迫切需要解決的重要問題。雖然臨床上有許多治療性藥物，但是人們更傾向于通過飲食代替藥物來防治，所以對于采用功能性食品來防治酒精性肝損傷正成為研究的熱點(diǎn)。酒精在人體內(nèi)通過氧化反應(yīng)進(jìn)行代謝，會消耗GSH，產(chǎn)生自由基，其代謝產(chǎn)物乙醛會被黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變成超氧化物，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝臟損傷[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，能用于判斷體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度；GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，其水平的高低可以標(biāo)示酒精性肝損傷時肝臟抗氧化能力的強(qiáng)弱[15]；TG則可以看出脂肪在肝細(xì)胞中堆積的情況[1]。

本研究中，分別給予小鼠以0.375、0.750、2.250 g/kg?bw為劑量的低、中、高劑量組牡蠣提取物經(jīng)口灌胃30 d后，以酒精造成急性肝損傷模型。模型組的MDA含量顯著升高，牡蠣提取物各劑量組的MDA水平隨著劑量的增加，逐漸下降，高劑量組的MDA水平降到接近空白組水平；模型組GSH水平顯著下降，而牡蠣提取物各劑量組的GSH水平提高，說明小鼠體內(nèi)發(fā)生了比較激烈的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量自由基，但灌胃牡蠣提取物后，GSH水平提高，以供機(jī)體對抗過氧化反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。這與淑英等[10]的研究結(jié)果一致，其研究表明富鋅牡蠣粉對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用，可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和抑制脂質(zhì)氧化有關(guān)。肝脂肪變性是由于肝臟肝細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)了脂肪滴，重度的脂肪變性可引起肝功能衰竭，甚至引起肝細(xì)胞壞死[16]。李文立等給小鼠灌胃了牡蠣粉，發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞氣球樣變的動物例數(shù)明顯減少，病變程度減輕，對四氯化碳(CCl4)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[17]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組的TG含量升高，牡蠣提取物各劑量組的TG含量有所降低；模型組肝臟的脂肪變性程度嚴(yán)重，達(dá)10余倍，灌胃不同劑量組的牡蠣提取物后，可以不同程度地緩解脂肪變性。由此可以推斷牡蠣提取物可能是通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶水平，對抗自由基生成，防止肝臟發(fā)生脂肪變性。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范2003版》的判定標(biāo)準(zhǔn)[18]，本實(shí)驗(yàn)中MDA、GSH和TG等3項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果均為陽性，判定牡蠣提取物對化學(xué)性肝損傷具有一定的輔助保護(hù)作用，可以作為一種具有保肝護(hù)肝功效的海洋保健食品進(jìn)行開發(fā)。由于本文中牡蠣提取物的主要成分為牡蠣多肽，因此，今后對于牡蠣多肽的保肝護(hù)肝功效及其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。