楊章武，張 哲，陳思源，葛 輝，陸承寬，林嘉銘，杜秀萍，鄭雅友，李正良，林克冰，游偉偉

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)原產(chǎn)于中南美洲太平洋沿岸水域，是目前我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的對蝦種類。閩南地區(qū)是我國重要的凡納濱對蝦苗種生產(chǎn)基地。凡納濱對蝦適溫范圍13～40℃[1]，因其屬熱帶性種類，而對低溫的耐受性較差[2]，并且由于種源限制以及水域生態(tài)環(huán)境退化等原因，我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖持續(xù)出現(xiàn)抗逆性退化、養(yǎng)殖存活率下降等現(xiàn)象。在大規(guī)模育苗生產(chǎn)中，探索有效、可行的凡納濱對蝦人工選育方法，提高凡納濱對蝦耐低溫能力，對閩南地區(qū)蝦苗業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

對蝦是變溫動(dòng)物，溫度的變化可直接影響它們的生長、繁殖、發(fā)育、代謝、攝食甚至存活[3]。對蝦耐低溫性狀屬于數(shù)量性狀(Quantitative traits)，易受生活環(huán)境的影響，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析數(shù)量性狀表型值，可以探究數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律[4]。不同遺傳背景的凡納濱對蝦人工選育群體雜交，其雜交子代仔蝦幼體耐低溫能力顯著提高[5]。溫度脅迫可影響凡納濱對蝦肝胰腺組織的抗氧化酶和消化酶活性及生長代謝和能量代謝等[6-7]。有關(guān)溫度對凡納濱對蝦生理機(jī)能、免疫指標(biāo)的影響研究，已有較多報(bào)道[8-12]。本文比較研究了人工選育凡納濱對蝦群體的自交和正、反雜交子代仔蝦幼體的耐低溫能力的實(shí)驗(yàn)，旨在探索人工篩選凡納濱對蝦具有耐低溫性狀子代的技術(shù)方法。

1 材料與方法

2018年5月31日在廈門市廈興龍公司晉江種蝦基地，用發(fā)育期為P11～P12的凡納濱對蝦仔蝦幼體進(jìn)行耐低溫實(shí)驗(yàn)。

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)蝦苗是本項(xiàng)目組自行選育留種的4個(gè)凡納濱對蝦種蝦繁育群體A、B、C、D，通過自交和正、反雜交繁育子代蝦苗共16組，同時(shí)隨機(jī)采購1組“土苗”(種蝦來自一般食用蝦養(yǎng)殖池的普通苗)。

1.1.1 種蝦群體

A群體：引進(jìn)自海南種蝦的自交2代；B群體：引進(jìn)自泰國種蝦自交2代；C群體：引進(jìn)自普瑞莫種蝦的自交2代；D群體：由兩個(gè)家系子代混合形成的群體，經(jīng)自交傳代6代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)蝦苗

1.1.1中4個(gè)選育群體種蝦自交和正、反雜交，形成16組蝦苗。按凡納濱對蝦常規(guī)育苗方法，培育至P11～P12。17號是隨機(jī)采購自廈門市海滄鰲冠村育苗場的發(fā)育期相同的“土苗”。表1是17組實(shí)驗(yàn)蝦苗的種質(zhì)來源情況及實(shí)驗(yàn)時(shí)的體長。

表1 凡納濱對蝦仔蝦幼體耐低溫實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)號種源與體長信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 設(shè)施

將挖好圓孔的塑料泡沫板漂浮在容積500 L的玻璃鋼圓桶水面，桶面直徑95 cm，用循環(huán)式冷水機(jī)制冷降溫。在不銹鋼漏杯內(nèi)放置實(shí)驗(yàn)蝦苗。漏杯直徑8 cm、高10 cm，吃水約450 mL，套在泡沫板圓孔里確保其浮于實(shí)驗(yàn)桶水面。

1.2.2 方法

玻璃鋼桶裝滿海水，冷水機(jī)制冷，使水溫達(dá)到初始實(shí)驗(yàn)水溫18℃。17組蝦苗，每組設(shè)3個(gè)平行，共51個(gè)漏杯，分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)桶同時(shí)進(jìn)行。

蝦苗從水溫28～30℃的育苗池取出，在自然水溫條件下計(jì)數(shù)并放入漏杯，每杯放苗50尾。在計(jì)數(shù)過程中，用泡沫箱裝上育苗池的水放入漏杯，計(jì)數(shù)后同時(shí)放入實(shí)驗(yàn)桶。計(jì)數(shù)時(shí)要選擇健康、無異常蝦苗。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到，蝦苗在12℃左右大量死亡，而且48 h時(shí)存活很少。據(jù)此，低溫實(shí)驗(yàn)設(shè)定實(shí)驗(yàn)最低溫度為14℃。低溫實(shí)驗(yàn)從18℃開始，每小時(shí)記錄水溫1次。實(shí)驗(yàn)開始后的6、12、24、36和48 h分別統(tǒng)計(jì)各杯死亡數(shù)量和存活數(shù)量。實(shí)驗(yàn)桶不間斷充氣，每個(gè)杯用吸管投放鹵蟲無節(jié)幼體。低溫實(shí)驗(yàn)的鹽度為28。

1)計(jì)數(shù)方法：用1個(gè)透明小塑料盆裝少量實(shí)驗(yàn)桶的水(水溫或鹽度保持一致)，實(shí)驗(yàn)杯移出放在小盆內(nèi)，用手電照射，用鑷子或吸管計(jì)數(shù)。

2)實(shí)驗(yàn)蝦苗體長測量：每組取蝦苗20尾，將其低溫凍死后置于方格紙上拍照。照片在Photoshop系統(tǒng)中以像素比例進(jìn)行長度測量。為便于照片上辨認(rèn)，以眼睛到尾扇末端的長度作為體長數(shù)據(jù)。

3)數(shù)據(jù)分析：使用SPSS 22對不同組別存活率進(jìn)行差異顯著性分析和多重比較。為綜合評價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的耐低溫能力，以存活率排名賦值法對不同時(shí)段的存活率進(jìn)行賦值排名，以總排名評價(jià)各組耐低溫能力。具體方法：同一時(shí)段各組存活率從大到小排名，第一名賦值1、第二名賦值2，以此類推，然后取各組在不同時(shí)段的排名均值作為該組的存活率總排名?？紤]到仔蝦幼體個(gè)體大小與耐低溫能力成正相關(guān)，即規(guī)格越大，耐低溫能力越強(qiáng)[5]。在本文分析比較由不同組種質(zhì)體現(xiàn)的耐低溫能力時(shí)，應(yīng)扣除因蝦苗規(guī)格大而增加的存活率部分，因此，在相同存活率情況下，體長越小說明其由種質(zhì)決定的耐低溫能力越強(qiáng)。從而，體長大小反映在(種質(zhì))耐低溫能力對應(yīng)的存活率排名上就是從小到大進(jìn)行排名，即體長最小的排名第一名，賦值為1。

4)耐低溫存活率雜交優(yōu)勢率估算：以雜交組雙親各自自交子代的存活率平均值作為該雜交組的雙親均值。雜交組存活率與雙親均值之差，與雙親均值之比為該雜交組的雜交優(yōu)勢率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)蝦苗從正常水溫28～30℃瞬間、同時(shí)進(jìn)入18℃實(shí)驗(yàn)水溫。實(shí)驗(yàn)水溫13.5～19.0℃，水溫變化見圖1。

2.1 不同種源仔蝦幼體低溫存活率差異分析

表2是不同親本組合各組仔蝦幼體低溫實(shí)驗(yàn)不同時(shí)長的累計(jì)平均存活率。在低溫6 h時(shí)水溫降至15.0℃(圖1)，各組存活率多數(shù)接近或大于95%，差異不明顯。隨著實(shí)驗(yàn)水溫下降和實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，各組存活率快速下降，并逐漸顯示組間差異。

在低溫實(shí)驗(yàn)12 h時(shí)水溫降至14.5℃，表2顯示各組存活率差異逐漸明顯，存活率最低有9號、12號兩組已降至約50%。從12 h到24 h期間，水溫曾回升到19.0℃然后又回落到14.0℃，存活率快速下降，不同組差異更明顯，10號已全部死亡，其中3組(4、12、15號)存活率只有個(gè)位數(shù)，而土苗組存活率還有近80%。從24 h到36 h期間，水溫先升到16.0℃，后降至13.5℃，全部死亡增加到2組(7、10號)，11號和17號存活率最高，分別為33.7%和43.7%。在48 h時(shí)全部死亡增加到5組(4、7、9、10、16號)。第17號土苗存活率最高，為30.4%，而且在實(shí)驗(yàn)過程中任何時(shí)間都顯著高于其他組，48 h的最后存活率是其他實(shí)驗(yàn)組的兩倍以上。土苗耐低溫的能力強(qiáng)于所有選育組。

表2 不同低溫時(shí)長凡納濱對蝦仔蝦幼體各組累計(jì)存活率

用SPSS 22對各組存活率進(jìn)行線性單變量分析。S-N-K多重比較，對同一實(shí)驗(yàn)時(shí)間各組歸類為若干子集，而同一子集則無顯著差異。分析結(jié)果顯示，在低溫6 h時(shí)17個(gè)實(shí)驗(yàn)號存活率在同一子集，存活率無顯著差異(P>0.05)；在低溫12 h時(shí)存活率最高的子集包含了11組，存活率為77.7%～97.5%。表3是低溫24、36和48 h時(shí)相應(yīng)最高存活率子集所包含的實(shí)驗(yàn)號。表3顯示，17號土苗存活率最高，三種實(shí)驗(yàn)時(shí)長都是單獨(dú)子集，與其他組差異顯著(P<0.05)。低溫24 h時(shí)，6號、2號在次低子集，與除1號和11號外的其他組差異顯著(P<0.05)。在低溫36 h時(shí)，11號也自成一個(gè)子集，在選育組中存活率最高，與其他組差異顯著(P<0.05)，而第1、第2和第6號是次高子集中存活率最高的3個(gè)組，但與其他12組存活率無顯著差異(P>0.05)。在低溫48 h時(shí)，第6號和第11號兩組屬于存活率僅次于17號的次高子集，與其他組差異顯著(P<0.05)。1號、2號同屬次高子集，但與其他12組存活率無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同低溫時(shí)長最高存活率子集

注：右上角標(biāo)注“##”或“#”的組號或存活率數(shù)據(jù)，表示其與同行各組為不同子集，存活率差異顯著(P<0.05)。無標(biāo)注的屬相同子集。

Notes：The group number or survival rate data marked with“##”or“#”in the upper right corner indicated that they were different subsets from each other.The difference of survival rate was significant(P<0.05).Identical subsets without mark.

分析表3的結(jié)果表明，在24、36、48 h時(shí)最高存活率子集中(17號除外)，最高的3組(2、6、11號)都是相同的，且36和48 h存活率高低排序(11>6>2)完全一致。不同實(shí)驗(yàn)時(shí)長的最高存活率子集都包含或僅有11、6和2號，表明在16個(gè)選育組中該3組存活率最高，耐低溫能力最強(qiáng)，且在24和48 h時(shí)與其他選育組差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同種源仔蝦低溫存活率排名賦值分析

凡納濱對蝦仔蝦不同組別在48 h低溫實(shí)驗(yàn)期間，不同時(shí)間段死亡率有所不同，死亡時(shí)間有早有晚。為綜合評價(jià)實(shí)驗(yàn)過程的整體耐低溫能力，從各組出現(xiàn)明顯差異的24 h開始，以不同時(shí)段存活率排名賦值進(jìn)行分析比較。低溫實(shí)驗(yàn)各組存活率排名賦值，存活率從大到小，體長從小到大，分別給予從1到17的賦值。賦值情況見表4。

表4 凡納濱對蝦仔蝦幼體低溫實(shí)驗(yàn)存活率、體長排名賦值表

續(xù)表4

表4顯示，綜合各實(shí)驗(yàn)時(shí)長存活表現(xiàn)和體長因素，16個(gè)交配組合中(17號土苗除外)存活率排名均值前3位分別是11號(C♀×A♂)、2號(B♀×A♂)和6號(A♀×A♂)，排名與SPSS多重分析結(jié)果重合。存活率最低、排名最后的3組，分別是10號(B♀×D♂)、7號(D♀×D♂)和8號(C♀×C♂)，該3組低溫48 h時(shí)平均存活率為0。

分析表4還顯示，存活率最高的3組均是A群種蝦的自交和雜交子代，與D群種蝦無關(guān)。而存活率最低的3組，除8號外其他3組均是D群種蝦的自交和雜交子代，4組都與A群種蝦無關(guān)。表明不同種源其子代仔蝦耐低溫能力有顯著差異。

2.3 蝦苗耐低溫能力與雜交優(yōu)勢的相關(guān)性

表5是根據(jù)低溫實(shí)驗(yàn)48 h時(shí)各組存活率，估算各組耐低溫存活率的雜交優(yōu)勢。表5顯示，存活率最高的雜交組11號和2號，48 h存活率雜交優(yōu)勢率分別是68.2%和11.7%。而耐低溫能力最差、排名最后的3個(gè)雜交組( 10、9和15號)的48 h存活率雜交優(yōu)勢率分別為-100%、-100%、-77.5%。不同種源仔蝦幼體耐低溫能力的雜交優(yōu)勢率有顯著差異。

表5 低溫實(shí)驗(yàn)48 h存活率的雜交優(yōu)勢估算

注：存活率是低溫48 h時(shí)的存活率，優(yōu)勢率是48 h存活率的雜交優(yōu)勢率。

Notes：The survival rate was the survival rate at 48 hours of low temperature，and the odds ratio was the heterosis rate at 48 hours of survival rate.

3 討論

1)從低溫實(shí)驗(yàn)過程存活率變化來看，各組存活率在實(shí)驗(yàn)6 h時(shí)差異不明顯，12 h開始有明顯差異。36 h多數(shù)存活率已經(jīng)很低，只有個(gè)位數(shù)。而48 h已經(jīng)有將近1/3的實(shí)驗(yàn)組存活率為0。因此，48 h 的觀察時(shí)長足以顯示不同組別的耐低溫能力。

用排名賦值對多個(gè)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合排名和評價(jià)，從感性上具有一定的合理性。排名賦值方法簡單、結(jié)果明晰，作為本文數(shù)據(jù)分析的輔助方法，其分析結(jié)論與常規(guī)分析方法結(jié)果相同，有相互印證的作用。但由于排名賦值是整數(shù)，相鄰兩個(gè)排名的排名賦值可能無法真正反映其存活率的實(shí)際差值，這會(huì)給最終排名帶來一定的誤差。

2)已有研究表明[13-15]，凡納濱對蝦、中國對蝦耐低溫性狀遺傳力為低等遺傳力。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同種質(zhì)來源的群體，蝦苗耐低溫能力確有顯著差異，而且這種差異與特定親本群體相關(guān)。在水產(chǎn)動(dòng)物雜交育種中，通過自交系間的雜交，可以獲得顯著的雜種優(yōu)勢[16]。雜交優(yōu)勢估算結(jié)果表明，不同親本群體，其子代蝦苗耐低溫存活率的雜交優(yōu)勢率顯著不同。這說明雖然凡納濱對蝦耐低溫性狀代際遺傳可能不穩(wěn)定，但耐低溫性狀可以是特定種質(zhì)群體在特定發(fā)育階段和棲息環(huán)境下的固有性狀。

進(jìn)一步的養(yǎng)殖對比實(shí)驗(yàn)(另文報(bào)道)還表明，耐低溫能力最強(qiáng)的3組(2、6、11號)，養(yǎng)成期生長速度在17個(gè)實(shí)驗(yàn)號中分別排名第2、5和6名，生長速度排名比較靠前。而耐低溫能力最弱的5組(4、7、9、10、16號)，養(yǎng)成期生長速度在17個(gè)實(shí)驗(yàn)號中分別排名第11、17、13、12名，生長速度排名顯著靠后。顯示仔蝦期耐低溫能力強(qiáng)的組合養(yǎng)成期生長快，耐低溫能力弱的組合養(yǎng)成期生長慢。這種現(xiàn)象是否具有普遍性還有待進(jìn)一步觀察，但可為性狀選擇提供參考。

3)“土苗”系指親本來源于一般商業(yè)化對蝦養(yǎng)殖池，種質(zhì)背景不夠清晰的普通凡納濱對蝦苗。因其生長性狀較差，不納入選育對象，只作為選育群體的對照組。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，土苗生長性狀很差，16個(gè)選育組除7號(D♀×D♂)體重生長速度低于土苗外，其他選育組養(yǎng)成期生長速度是土苗的1.18～2.10倍(另文分析)，但土苗耐低溫能力特別強(qiáng)，同時(shí)耐低鹽能力又特別弱(另文分析)。與4個(gè)基礎(chǔ)群體(A、B、C、D)子代比較，土苗是隨機(jī)采購自蝦苗市場的，沒有對耐低溫、低鹽性狀的定向選育，卻有著最強(qiáng)的耐低溫能力和最弱的耐低鹽能力，這為凡納濱對蝦選擇育種研究提出了需要進(jìn)一步探索的問題。