李鑫佳，姜愛莉

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺264000)

海參(Sea cucumber，Holothurian)，又名海鼠、海地瓜，是一種珍貴的海洋生物，海參富含蛋白質(zhì)，含有少量脂肪，幾乎不含膽固醇，是優(yōu)良的滋補食品[1]。作為我國的一種傳統(tǒng)中藥，海參有著養(yǎng)血潤燥、補腎益精等功效，自古以來便是滋補的名貴食品和防治一些疾病的良藥[2]。近年來，海參中多種具有調(diào)節(jié)生理活性的功能性化學(xué)物質(zhì)被陸續(xù)分離獲得，如海參多糖[3]、三萜皂苷[4]、脂肪酸[5]、多肽[6]、神經(jīng)節(jié)苷脂[7]等。

海參皂苷是一類活性很強的物質(zhì)，在海參體壁和內(nèi)臟中分泌得到。海參皂苷為三萜皂苷，其結(jié)構(gòu)多為羊毛甾烷型[8]。海參皂苷是由苷元和糖鏈通過β-O糖苷鍵結(jié)合而成，苷元常為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，組成寡糖苷的單糖主要有：木糖、葡萄糖、喹喏糖(quinose)、3 - 甲基木糖、3 - 甲基葡萄糖等[9]。按照苷元的類型，海參皂苷可以分為兩種：海參烷型和非海參烷型；海參烷型苷元一般為 18(20)-內(nèi)酯環(huán)，非海參烷型苷元有18(16)-內(nèi)酯環(huán)或無內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)[10]；比較常見的為海參烷型，偶有非海參烷型。海參皂苷的分離純化過程繁瑣復(fù)雜，要得到單體化合物具有很大困難。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)海參皂苷具有抗真菌、抗腫瘤、溶血以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。尹藝等[11]研究指出，海參皂苷具有防輻射、延緩衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高免疫力及記憶力、改善尿頻癥狀等多重功效。叢日山等[12]進行的研究中發(fā)現(xiàn)，海參皂苷具有抗真菌的作用。童靜靜等[13]研究指出，海參皂苷具有抑制腫瘤細胞生長和擴散的作用。羅臻等[14]研究發(fā)現(xiàn)，海參皂苷具有提高胰島細胞的活性、降血糖的作用。

海參皂苷極性較大，易溶于極性較大的溶劑，并且海參內(nèi)有較多磷脂類物質(zhì)，因此一般采用醇提法，既去除脂肪酸，又節(jié)約成本。目前，對于海參皂苷的提取方法多為回流提取法[15]、醇-醇提取法[16]、水提取法[17]、冷浸提取法[18]，提取過程中均有糖和蛋白質(zhì)的溶出，給后續(xù)純化帶來困難。本實驗從料液比、乙醇濃度、提取溫度三個方面考察不同條件對海參皂苷提取的影響，以及糖和蛋白質(zhì)的獲得情況，為海參皂苷的提取制備提供基礎(chǔ)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海參：煙臺本地市場購買的干海參，外壁呈深黑色，去離子水常溫下浸泡24 h，攪碎分裝(25±1 )g，低溫保存。

香草醛、冰醋酸、濃硫酸等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；ST16高速離心機(4000-40000轉(zhuǎn))，賽默飛世爾科技公司；HH-4S數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 皂苷的提取方法

取25 g海參，按照設(shè)定料液比加入乙醇溶液，恒溫攪拌提取，每隔2 h取樣，離心后測上清液中皂苷含量；每4 h測上清液中多糖和蛋白質(zhì)含量。提取結(jié)束后，將提取液過濾離心，得到海參皂苷粗提液。

1.3.2 考察因素及水平

1)乙醇濃度：0%(純水)、20%、40%、60%、80%；

2)溫度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；

3)料液比(W/V)：1∶10、1∶15、1∶20。

1.4 測定方法

1.4.1 海參皂苷測定方法

參照香草醛-高氯酸顯色體系[19]，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)，5 mL 60%(V/N)硫酸，混勻，60℃水浴反應(yīng)20 min，室溫放置10 min，以蒸餾水代替海參皂苷溶液作為空白參比，560 nm測定吸光度。按照上述方法繪制標準皂苷(Serva進口分裝，北京希凱創(chuàng)新科技有限公司)標準曲線。標準曲線的回歸方程為C=14.11A-0.000 5，其中R2=0.999 5，A為吸光度值，C為標準皂苷濃度(mg/mL)。計算提取液中皂苷提取率mg/g(干海參)。

1.4.2 多糖測定方法

采用苯酚-硫酸法[20]，葡萄糖為標準品。計算提取液中多糖提取率mg/g(干海參)。

1.4.3 蛋白質(zhì)測定方法

采用考馬斯亮藍法[21]，牛血清蛋白為標準品。計算提取液中蛋白質(zhì)提取率mg/g(干海參)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對海參皂苷提取的影響

圖1和圖2是在20℃恒溫條件下，5種濃度乙醇提取時提取液中海參皂苷、多糖、蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果。

用40%、60%乙醇提取時，提取液中海參皂苷含量隨提取時間變化較大，前4 h海參皂苷含量隨提取時間持續(xù)增加至最高值，超過4 h，提取液中皂苷含量有較大程度下降(6 h)，并在6～10 h內(nèi)保持較低值，這可能與在此提取過程中有大量多糖產(chǎn)生，而其與皂苷相互結(jié)合使皂苷沉淀析出有關(guān)，10 h后皂苷提取率略有增加；用20%、80%乙醇提取時，前4 h海參皂苷含量隨時間增加，6～8 h時海參皂苷含量略有降低，之后隨時間增長，海參皂苷含量有所上升；用0%乙醇(純水)進行提取時，10 h之內(nèi)，隨著提取時間增加，提取液中海參皂苷含量逐漸增加，10 h后海參皂苷含量略有下降。

5種濃度乙醇的提取液中的多糖含量均隨時間延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，提取8 h時，提取液中多糖含量較高；60%、80%乙醇的提取液中多糖含量變化程度較大，又以80%乙醇提取液中多糖含量最高，0%、20%、40%乙醇的提取液中多糖含量變化幅度較小。

用20%、40%乙醇提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量隨提取時間的延長略有增加；用80%乙醇提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量變化不大；60%乙醇提取8 h時，提取液中蛋白質(zhì)含量顯著低于4 h時，之后略微升高；用0%乙醇(純水)提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量增加較多，提取結(jié)束時，蛋白質(zhì)含量較多。

從上述結(jié)果可以看出，提取8 h時，皂苷提取較為完全，濃度為0%和80%的乙醇對海參皂苷的提取率較高；0%乙醇(純水)提取液中多糖含量較少，蛋白質(zhì)含量較高；80%乙醇提取液中多糖含量較高，蛋白質(zhì)含量較少。由于蛋白質(zhì)在后續(xù)分離過程中可以通過鹽析、沉淀等方式比較方便地去除，而多糖則較難去除，因此選用0%乙醇(純水)進行海參皂苷的提取。

2.2 溫度對海參皂苷提取的影響

圖3和圖4是純水在不同溫度下對海參皂苷、多糖、蛋白質(zhì)的提取結(jié)果。

不同溫度提取時，隨著時間的延長，海參皂苷提取率略有升高，8～10 h后，提取液中皂苷含量有所波動。不同提取溫度比較，在實驗設(shè)定的較高溫度60℃下提取，皂苷得率較高。20℃、30℃、50℃提取12 h，提取液中皂苷含量顯著高于最初提取(2 h)時。

20℃、30℃、40℃、50℃提取時，隨著提取時間延長，提取液中的多糖含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，其中40℃提取時變化幅度最大；60℃提取時，提取液中多糖含量隨提取時間增加緩慢下降。5種溫度下，20℃提取時提取液中多糖含量最低，60℃最高。

20℃提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量低于其他溫度，隨時間逐漸增加，8 h后趨于穩(wěn)定；30℃和60℃提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量呈先減少后增加的趨勢；40℃提取時，前8 h內(nèi)提取液中蛋白質(zhì)含量基本穩(wěn)定，之后蛋白質(zhì)含量逐漸降低；50℃提取時，提取液中蛋白質(zhì)含量隨提取時間緩慢增加。

從整體提取效果看，60℃提取時，皂苷得率最高，提取液中多糖和蛋白質(zhì)含量也最多，后續(xù)除雜過程復(fù)雜，從海參中提取多糖的最佳提取溫度也多為60℃[22]，大大增加了后續(xù)皂苷純化難度；隨著水浴溫度上升，提取液中海參皂苷含量波動較大，這可能與皂苷的熱不穩(wěn)定性有關(guān)，因此，應(yīng)注意在較高溫度提取海參皂苷時，時間不宜過長，以免破壞皂苷結(jié)構(gòu)；20℃、30℃提取時，提取液中皂苷含量明顯上升，而20℃提取液中多糖、蛋白質(zhì)含量低于30℃提取液，因此采用20℃提取，可以有效簡化分離提純步驟，節(jié)約成本。

2.3 料液比對海參皂苷提取的影響

圖5和圖6是用純水在20℃提取時，3種料液比提取液中海參皂苷、多糖、蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果。

提取過程中海參皂苷含量隨提取時間增加而增加；3種料液比提取液中海參皂苷含量排序：1∶15提取液>1∶20提取液>1∶10提取液。這可能與料液比為1∶20時，提取液中多糖、蛋白質(zhì)含量均較高，與提取所得皂苷結(jié)合后發(fā)生沉降，導(dǎo)致上清液中皂苷含量較低。

料液比為1∶10、1∶20時，提取液中多糖含量隨時間延長先增加后降低，在8 h時達到最大值，料液比為1∶20時提取液中多糖含量下降更多；料液比為1∶15時，提取液中多糖含量隨時間延長先降低后增加，在8 h時最低，這可能與提取出的某些堿性物質(zhì)將多糖的糖鏈裂解有關(guān)。

料液比為1∶10時和1∶20時，8 h內(nèi)提取液中蛋白質(zhì)含量逐漸增加，之后略有下降；料液比為1∶15時，提取液中蛋白質(zhì)含量隨時間變化不大。

從上述結(jié)果可以看出，料液比為1∶15進行提取時，提取液中海參皂苷含量較高，而且提取過程中糖和蛋白質(zhì)提出率較低。提取過程中，海參皂苷在8 h左右達到最高值，之后含量基本穩(wěn)定，提取液中多糖和蛋白質(zhì)含量在8 h時均較低，因此，提取時間可控制在8 h，既縮短了時間，也能保證得到皂苷含量高、雜質(zhì)少的提取液。

3 結(jié)論

本實驗采用攪拌提取法提取海參皂苷，針對影響提取率的乙醇濃度、溫度、料液比設(shè)計提取實驗，通過比較海參皂苷、多糖和蛋白質(zhì)含量，選出了合適的海參皂苷提取條件。實驗結(jié)果表明，提取海參皂苷時，用0%乙醇(純水)、料液比為1∶15、20℃恒溫進行提取，提取時間控制在8 h，可以有效提高海參皂苷得率，控制雜質(zhì)產(chǎn)生，節(jié)約提取成本，簡化分離提純步驟。