張靖，馬彥軍，賀隆基，張成君

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

胡楊Populus euphratica，具有極強(qiáng)的抗逆性，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是西部林業(yè)生態(tài)建設(shè)的先鋒樹(shù)種。有關(guān)胡楊愈傷組織的研究報(bào)道比較少，馬艷[1]研究了胡楊葉片組織培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)果表明葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為WPM+0.4 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，朱小虎[2]研究以胡楊的雄花、花序軸為外植體篩選出最佳外植體，結(jié)果表明花序軸為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體，誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，愈傷組織增殖最佳培養(yǎng)基為MS或LS培養(yǎng)基。本研究以胡楊當(dāng)年生嫩枝為外植體，通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，篩選出最佳的消毒方式以及培養(yǎng)基，來(lái)實(shí)現(xiàn)胡楊愈傷組織的高效誘導(dǎo)和快速增殖，建立胡楊愈傷組織誘導(dǎo)和增殖體系，以期為后續(xù)胡楊的無(wú)性繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

取樣地點(diǎn)位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)，103°70′E、36°09′N，海拔1 514.81 m。取樣日期2019年5月上旬。剪取胡楊南向嫩枝為樣枝，當(dāng)年生，未木質(zhì)化，保濕帶回室內(nèi)備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體預(yù)處理

供試枝條剪去兩端，保留中間一段用作外植體，長(zhǎng)2～3 cm，帶腋芽 3～4個(gè)，同時(shí)剪去葉片，保留一小段葉柄。軟毛刷仔細(xì)刷洗枝段，流水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上，枝段先用75%酒精消毒 2～3 s，無(wú)菌水沖洗 3 次，0.1% HgCl2滅菌，無(wú)菌水沖洗后，剪去葉柄，植入培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 滅菌試驗(yàn)

將酒精消毒處理過(guò)的枝段經(jīng)0.1% HgCl2滅菌后植入MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。0.1% HgCl2滅菌設(shè)置 5 個(gè)處理時(shí)間，分別為 0、4、6、8、10 min。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，每隔3 d觀察1次，記錄數(shù)據(jù)，2周后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。篩選出合適的滅菌方案。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將0.1% HgCl2滅菌過(guò)的外植體接種到培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)愈傷組織。3種培養(yǎng)基為MS、B5、White，添加不同濃度、不同組合的6-BA、NAA為處理，見(jiàn)表1。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)。接種后每隔3 d觀察1次，記錄愈傷組織的生長(zhǎng)狀況。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 愈傷組織增殖

誘導(dǎo)形成的愈傷組織切成小塊，長(zhǎng)寬約0.5 cm，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)增殖，基本培養(yǎng)基添加不同濃度、不同組合的6-BA、NAA為處理，見(jiàn)表2。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，3次重復(fù)。接種后每隔3 d觀察1次，記錄愈傷組織的生長(zhǎng)。40 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

表2 愈傷組織增殖實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基中均添加蔗糖25 g/L，瓊脂6 g/L，pH 調(diào)至 5.8～6.0，培養(yǎng)室溫度（22±2）℃，光 /暗周期 12 h/12 h，光照強(qiáng)度 1 400～2 000 lx，培養(yǎng)室濕度 50%～65%。

全部數(shù)據(jù)利用SPSS19進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌試驗(yàn)

由圖1可知，0.1% HgCl2滅菌6 min效果最好，成活率可到達(dá)86.67%，污染率10%。0.1% HgCl2滅菌8、10 min，外植體生長(zhǎng)初期與滅菌6 min的處理類似，但后期成活率低。

圖1 不同消毒時(shí)間下外植體污染率及成活率

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

不同濃度的激素對(duì)胡楊愈傷組織誘導(dǎo)有不同的影響，如圖2所示。首先，與對(duì)照（處理1）相比，添加誘導(dǎo)激素的各處理有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且誘導(dǎo)率相差懸殊，說(shuō)明誘導(dǎo)激素在愈傷組織形成中具有決定意義；其次，相同培養(yǎng)基處理之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其三，處理2與B5、White 2種培養(yǎng)基的處理有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與同為MS培養(yǎng)基的處理3無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但誘導(dǎo)率較高。綜合分析，處理2為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，誘導(dǎo)率可達(dá)到83.3%。觀察發(fā)現(xiàn)，處理2誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，呈團(tuán)狀。因此，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

圖2 不同培養(yǎng)基與激素濃度下愈傷組織誘導(dǎo)率

2.3 愈傷組織增殖

初代培養(yǎng)所得到的愈傷組織數(shù)量較少，為了獲得大量的愈傷組織，增殖培養(yǎng)必不可少。增殖結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，首先，添加激素的各處理增殖程度明顯高于對(duì)照（處理10），說(shuō)明添加激素對(duì)愈傷組織的增殖具有重大意義。其次，分析表明，當(dāng)6-BA與NAA的濃度比值為1時(shí)，有利于愈傷組織的增殖。以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，愈傷組織增值效果最佳，所得愈傷組織呈黃綠色，結(jié)構(gòu)疏松，長(zhǎng)勢(shì)最好。同時(shí)，6-BA的濃度0.01～0.05 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織增殖程度逐漸增加；6-BA濃度0.10 mg/L時(shí)，隨著NAA的濃度增加，愈傷組織增殖程度逐漸降低。

表3 不同激素對(duì)愈傷增殖的影響

3 討論

植物細(xì)胞、組織、器官脫分化形成愈傷組織。愈傷組織的形成分為誘導(dǎo)期、分裂期和形成期3個(gè)階段。培養(yǎng)基種類、激素種類、濃度及其不同組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化起著重要的作用[3]，同一植物種類，同一外植體在不同激素種類及不同濃度的組合下愈傷組織誘導(dǎo)率和增殖效果不同。本實(shí)驗(yàn)以胡楊的嫩枝為外植體，首先確定最佳的消毒方案，然后通過(guò)對(duì)比不同培養(yǎng)基以及激素濃度配比的結(jié)果，篩選出誘導(dǎo)胡楊愈傷組織和促進(jìn)愈傷組織增殖最佳的配方。實(shí)驗(yàn)表明，用0.1% HgCl2處理6 min，污染率較低同時(shí)成活率最大，為最佳處理結(jié)果。0.1% HgCl2處理8、10 min的污染率低，但后期成活率也低。這種情況可能是HgCl2對(duì)外植體有毒害作用，隨著時(shí)間的延遲，毒害作用越大，外植體的存活率越低。這與聶玉鴻[4]所研究的胡楊嫩枝最佳消毒時(shí)間不一樣，造成差異的可能原因，首先是外植體不同。聶玉鴻[4]外植體取自室內(nèi)培養(yǎng)發(fā)芽抽生的未木質(zhì)化嫩枝，長(zhǎng)3～5 cm，而本項(xiàng)研究為室外發(fā)芽抽生的未木質(zhì)化嫩枝。其次，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)酒精消毒時(shí)間不同。研究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基添加0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA最有利于愈傷組織誘導(dǎo)。本文未涉及不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，但通過(guò)朱小虎[2]的試驗(yàn)可以說(shuō)明，不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率不同，其原因可能是外植體的脫分化難易程度不同以及不同外植體所需的培養(yǎng)條件也不一致。

不同激素的濃度與配比對(duì)愈傷組織的增殖具有重要意義[5]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA與NAA濃度比為1時(shí)，有利于愈傷組織的增殖。在愈傷組織形成的過(guò)程中，激素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的第一信使，通過(guò)調(diào)節(jié)植物基因活性，誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，相應(yīng)蛋白的多少可以反應(yīng)愈傷組織的形成和增殖程度[6]。6-BA與NAA的相互作用，不同濃度的配比共同控制其蛋白的合成，當(dāng)6-BA與NAA濃度比值為1時(shí)，相應(yīng)的蛋白含量最多，愈傷組織增殖程度最好。當(dāng)6-BA濃度0.01～0.05 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的增殖效果越好，說(shuō)明增殖激素對(duì)愈傷組織的增殖具有重要意義。當(dāng)6-BA濃度0.10 mg/L時(shí)，隨著NAA的濃度增加，愈傷組織增殖值程度逐漸降低，表明高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的增殖起著抑制作用。MS+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為愈傷組織增殖最佳培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

胡楊嫩枝最佳消毒方案為0.1% HgCl2處理6 min，適合胡楊嫩枝愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。