張妍，楊成超

（遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213）

過冷水在攝氏零度以下仍保持液態(tài)，小體積純水甚至到－40 ℃而不結(jié)冰。水從液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變需要冰核催化。大量研究證明，冰核活性細(xì)菌（Ice nucleation active bacteria，簡(jiǎn)稱冰核細(xì)菌）廣泛存在[1]，可在－2～－3 ℃誘發(fā)植物細(xì)胞水結(jié)冰造成凍害，沒有冰核細(xì)菌植物一般可耐－6～－7℃低溫。1974年，Maki首次從赤楊葉片中分離到冰核細(xì)菌[2]；Hirana等指出丁香假單胞菌Pse udomonas syringae pv. syringae是加重楊樹凍害的冰核細(xì)菌[3]。在我國東北地區(qū)，冰核細(xì)菌廣泛存在，容易導(dǎo)致楊樹發(fā)生凍害[4]，給林業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失[5-7]。楊樹遭受凍害，不能正常發(fā)芽，生長不良乃至枯死。樹木防凍防病膜劑由楊成超等根據(jù)農(nóng)藥學(xué)原理研制而成[8]，本文結(jié)合室內(nèi)抑菌試驗(yàn)和田間模擬試驗(yàn)檢驗(yàn)其效果。

1 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)在遼寧省凌海市金城鎮(zhèn)進(jìn)行。凌海市位于遼寧省西南部，南臨遼東灣，北依松嶺山余脈，地處遼西走廊的咽喉地帶。年均氣溫8.6 ℃，年均降水600 mm，屬于北溫帶大陸性氣候。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

供試冰核細(xì)菌：丁香假單胞菌（株系編號(hào)2090，簡(jiǎn)稱2090菌），菠蘿泛生氏菌Pantoea ananas（株系編號(hào)1332，簡(jiǎn)稱1332菌）。2個(gè)菌種均購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

供試藥劑：樹木防凍防病膜劑（簡(jiǎn)稱膜劑），農(nóng)用鏈霉素（簡(jiǎn)稱鏈霉素）。膜劑由遼寧省楊樹研究所提供，主要成分為殼聚糖、丙三醇、乙二醇、磷酸二氫鉀、二甲基亞砜、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。鏈霉素為72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑，購自重慶濟(jì)公農(nóng)牧藥業(yè)有限公司。

供試楊樹無性系：中遼1號(hào)Populus×canadensis cv.‘Zhongliao 1’、108楊P.×canadensis ‘Guariento’。試驗(yàn)林密度2 m×6 m，林齡1 a，平均高2.6 m，平均胸徑2 cm。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

冰核細(xì)菌抑制試驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法。1332菌斜面活化后，接種環(huán)挑取兩環(huán)菌體稀釋到10 ml無菌生理鹽水中，振蕩均勻，制成菌懸液。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面加0.1 ml菌懸液，玻璃棒涂抹均勻，制成含菌培養(yǎng)皿。直徑0.6 cm無菌濾紙圓片藥液中浸泡10 min，無菌鑷子取出貼于含菌培養(yǎng)皿表面，每皿3片，“品”字形等距排布。培養(yǎng)皿置29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定濾紙圓片周圍的抑菌環(huán)環(huán)寬，用以代表抑菌效果[9]。

膜劑、鏈霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)3個(gè)水平：0.03%、0.06%、0.10%。按藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)劃分對(duì)比組，每組以無菌水為對(duì)照。共9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)皿。

2.2.2 田間模擬試驗(yàn)

冰核細(xì)菌接種與膜劑防治試驗(yàn)在田間進(jìn)行。接種菌制成108個(gè)/ml菌懸液。供試樹距梢頂80 cm選擇飽滿芽1個(gè)，解剖針等距環(huán)刺3處，脫脂棉浸蘸菌懸液包敷傷芽，外包保鮮膜。2 d后除膜除棉，均勻涂施膜劑，記號(hào)筆標(biāo)記接種芽[10]。2018年10月下旬接種，翌年4月25日統(tǒng)計(jì)接種芽萌發(fā)率。

108楊、中遼1號(hào)全組合接種1332菌、2090菌，分別以滅菌水為對(duì)照；膜劑設(shè)3個(gè)水平：無、2倍稀釋液、5倍稀釋液。共14個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株樹。

DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Excel軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 室內(nèi)抑制試驗(yàn)

膜劑抑制冰核細(xì)菌1332菌及其與鏈霉素對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見表1。

在給定置信水平下，兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩個(gè)處理之間效果不同；否則效果相同，數(shù)值差異屬于隨機(jī)誤差。根據(jù)上述統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，由表1可以看出：各對(duì)比組膜劑抑菌效果均不同于對(duì)照和0.10%鏈霉素，0.10%鏈霉素抑菌效果不同于對(duì)照。0.03%膜劑抑菌效果不同于0.06%膜劑、0.10%膜劑；0.06%膜劑與0.10%膜劑抑菌效果相同。

3個(gè)對(duì)比組對(duì)照的抑菌環(huán)環(huán)寬均為0 mm，說明無菌水處理無抑菌效果。抑菌環(huán)環(huán)寬：各對(duì)比組膜劑均大于無菌水和0.10%鏈霉素，0.10%鏈霉素大于無菌水，說明0.10%鏈霉素抑菌有效，膜劑抑菌有效且效果優(yōu)于0.10%鏈霉素；膜劑不同水平之間抑菌環(huán)環(huán)寬：0.03%膜劑＜0.06%膜劑＜0.10%膜劑，說明隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，膜劑抑菌效果增強(qiáng)。

表1 不同藥劑處理對(duì)冰核細(xì)菌1332的抑制效果

上述分析表明，膜劑抑制1332菌有效，抑菌效果優(yōu)于鏈霉素，并且隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而增強(qiáng)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定數(shù)值時(shí)抑菌效果達(dá)到最大。

各處理間差異極顯著，方差分析表見表2。

表2 方差分析

采用Tukey法多重比較對(duì)不同處理的抑菌圈直徑進(jìn)行比較，見表3?？梢钥闯龇纼龇啦∧┑囊志Ч@著優(yōu)于農(nóng)用鏈霉素，且FDM隨著濃度的增大抑菌效果有所增強(qiáng)。但是0.06%濃度與0.10%濃度的防凍防病膜劑對(duì)冰核細(xì)菌的抑菌效果達(dá)到了同一水平。

表3 Tukey法多重比較字母標(biāo)記法

3.2 田間模擬試驗(yàn)

108楊與中遼1號(hào)接種冰核細(xì)菌及膜劑防治試驗(yàn)結(jié)果見圖1。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理分析，由圖1可以看出：4個(gè)無膜劑處理的效果均不同于對(duì)照；8個(gè)膜劑處理的效果均不同于無膜劑處理。108楊接種1332菌、中遼1號(hào)接種1332菌和2090菌，6個(gè)膜劑處理的效果與2個(gè)對(duì)照相同；108楊接種2090菌，2個(gè)膜劑處理的效果不同于對(duì)照。同一無性系同一冰核細(xì)菌接種，膜劑2倍液與5倍液處理的效果相同。

圖1數(shù)據(jù)顯示：2個(gè)對(duì)照處理的接種芽萌發(fā)率均為100%，說明自然狀態(tài)下接種芽萌發(fā)正常，沒有發(fā)生凍害。4個(gè)無膜劑處理的接種芽萌發(fā)率低于對(duì)照且數(shù)值很小，說明冰核細(xì)菌引發(fā)了接種芽嚴(yán)重凍害。8個(gè)膜劑處理的接種芽萌發(fā)率均高于無膜劑處理，說明膜劑防治冰核細(xì)菌危害有效。108楊接種1332菌、中遼1號(hào)接種1332菌和2090菌，6個(gè)膜劑處理的接種芽萌發(fā)率同于2個(gè)對(duì)照，說明膜劑完全消除了冰核細(xì)菌引發(fā)的凍害；108楊接種2090菌，2個(gè)膜劑處理的接種芽萌發(fā)率低于對(duì)照，說明膜劑部分消除了冰核細(xì)菌引發(fā)的凍害。同一無性系同一冰核細(xì)菌接種，膜劑2倍液與5倍液處理的接種芽萌發(fā)率相同或相近，說明二者防治效率相近。

上述分析表明，膜劑對(duì)1332菌和2090菌防治有效，甚至完全消除兩種冰核細(xì)菌引發(fā)的108楊、中遼1號(hào)凍害，防治效率因菌種、無性系而存在一定差異；膜劑稀釋2倍液和5倍液的防治效率相近。膜劑處理的冰核細(xì)菌接種芽萌發(fā)情況見圖1。

從圖1還可以看出，4個(gè)無膜劑處理的接種芽萌發(fā)率不同，說明1332菌、2090菌引發(fā)108楊和中遼1號(hào)楊樹無性系的凍害的嚴(yán)重程度不同，即不同冰核細(xì)菌對(duì)同一楊樹無性系危害程度不同，同一楊樹無性系感染不同冰核細(xì)菌受害程度也不相同。這一結(jié)果暗示，針對(duì)不同冰核細(xì)菌種類和不同楊樹無性系，膜劑防治效率存在一定差異。

4 結(jié)論與討論

圖2 膜劑處理及冰核細(xì)菌接種芽萌發(fā)率

室內(nèi)抑菌試驗(yàn)和田間模擬試驗(yàn)表明，樹木防凍防病膜劑抑制菠蘿泛生氏菌1332株系有效，抑菌效果優(yōu)于農(nóng)用鏈霉素；對(duì)菠蘿泛生氏菌1332株系、丁香假單胞菌2090株系防治有效，甚至完全消除2種冰核細(xì)菌引發(fā)的108楊、中遼1號(hào)凍害，防治效率因菌種、無性系而存在一定差異。因此，樹木防凍防病膜劑能夠有效防治冰核細(xì)菌危害。

冰核細(xì)菌引發(fā)的樹木越冬凍害不僅發(fā)生在楊樹上，也發(fā)生在其他經(jīng)濟(jì)、綠化等樹木上。樹木防凍防病膜劑含有多種有效成分，不僅具有良好的抑菌殺菌作用，還具有保溫、增溫、防凍、防失水等功能。進(jìn)一步防治試驗(yàn)研究，樹木防凍防病膜劑有望推廣到其他樹種，也有望擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。