王婷婷，張繼東

(遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室暨貴州省基因檢測(cè)與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

睪丸形成及精子發(fā)生是一個(gè)精細(xì)、復(fù)雜的過(guò)程,需要各種細(xì)胞之間復(fù)雜的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控,包括各種基因、蛋白、激素、細(xì)胞因子的相互作用[1]。Wnt、TGF-β、Notch、Hedgehog均能夠調(diào)控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生,而且TGF-β1與上述四條經(jīng)典通路密切相關(guān)[2-3]。TGF-β1信號(hào)通路中的許多配體在哺乳動(dòng)物睪丸形成以及精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。新生期睪丸中，包括Nodal、TGF-β、Activins和BMP在內(nèi)的幾種配體在調(diào)節(jié)雄性生物學(xué)功能、生殖細(xì)胞增殖以及睪丸血管形成等起到重要作用，其中TGF-β1在胚胎期睪丸的形成以及發(fā)育中可調(diào)節(jié)睪丸生殖細(xì)胞的增殖和分化，也可通過(guò)調(diào)節(jié)支持細(xì)胞增殖和分化來(lái)決定睪丸的大小。Sarraj等利用 Tgfbr3(TGF-β共受體)敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，睪丸生精小管的基膜非常薄而且不具有連續(xù)性，由此可以說(shuō)明TGF-β1對(duì)睪丸生精小管的形成起著重要的作用[4]。此外，TGF-β1超家族信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于睪丸形成不可或缺，當(dāng)TGF-β1信號(hào)通路發(fā)生異常后，會(huì)導(dǎo)致睪丸病變，而且也會(huì)導(dǎo)致男性生育能力的降低[5-6]。

1 TGF-β1信號(hào)通路

TGF-β信號(hào)通路超家族包括30多種不同配體類型的TGF-β/Activin/Nodal和BMP蛋白家族，以旁分泌或自分泌方式激活Ⅰ型和Ⅱ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶(分別為TGF-βRI/II and BMP-RI/II)典型信號(hào)后，通過(guò)激活SMAD轉(zhuǎn)錄因子(R-SMADs)相應(yīng)的通路進(jìn)行傳導(dǎo)，這些通路與其他受體系統(tǒng)一起形成廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在典型的信號(hào)傳導(dǎo)中，I型受體參與R-SMADs的磷酸化，包括SMAD2/ SMAD3/TGF-β/ Activin/ Nodal信號(hào)通路和BMP信號(hào)通路中的SMAD1/5/8。R-SMADs與SMAD4相互作用進(jìn)行核移位，并與不同的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這些途徑調(diào)控多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育以及生理過(guò)程[7]。TGF-β1是一種調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)和病理生理過(guò)程的多效性細(xì)胞因子[8]。

眾所周知，TGF-β1/SMAD誘導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)通路中，TGF-β1首先直接與TβR-2結(jié)合形成相應(yīng)的復(fù)合物，然后TGF-β1構(gòu)象可以發(fā)生改變，被TβR-1識(shí)別之后，結(jié)合形成了TβR-2-TGF-β-TβR-1的一個(gè)三聚體的復(fù)合物，其中復(fù)合物中的TβR-1可以被TβR-2磷酸化，其底物將信號(hào)放大，并且進(jìn)一步向下游傳遞，此為配體與受體的重要結(jié)合方式，由此稱之為募集式[9]。當(dāng)在細(xì)胞膜上的TβR-1和TβR-2受體同時(shí)表達(dá)時(shí)，他們與配體的親和力能夠達(dá)到最大的作用效果[10]。如圖1所示，該信號(hào)通路是通過(guò)配體與TGF-βII 型受體結(jié)合而啟動(dòng)后，活性TNβRI激酶催化TGF-β/激活素受體調(diào)節(jié)的SMAD(AR-SMAD:即SMAD2和SMAD3)磷酸化。這兩個(gè)磷酸化的AR-SMAD與SMAD4形成三元的復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，形成的該復(fù)合物，可以與其它相應(yīng)的幾種輔助因子以及轉(zhuǎn)錄因子共同彼此作用，用來(lái)調(diào)控TGF-β1的靶基因[10-12]。在生命活動(dòng)中，TGF-β1信號(hào)通路調(diào)控眾多細(xì)胞間作用，發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及遷移等[13]。

圖1 TGF-β1信號(hào)通路圖示意圖

2 TGF-β1信號(hào)通路介導(dǎo)的生物學(xué)功能

TGF-β1及其下游分子 SMAD 可以調(diào)節(jié)大鼠睪丸的功能，而且對(duì)大鼠精子的發(fā)生、發(fā)育及其成熟的過(guò)程都起著關(guān)鍵性的作用，TGF-β1表達(dá)于大鼠睪丸體細(xì)胞中的支持細(xì)胞的胞質(zhì)、早期精母細(xì)胞以及圓形精子細(xì)胞，而且有研究表明TGF-β1及其受體在哺乳動(dòng)物睪丸中的表達(dá)具有種屬特異性，表達(dá)水平根據(jù)睪丸的不同發(fā)育階段不同，并與生精上皮發(fā)育的周期性有關(guān)[14-18]。成年羊駝睪丸的TGF-β1表達(dá)于體細(xì)胞中的支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞以及各級(jí)生精細(xì)胞，并且能夠調(diào)控羊駝精子發(fā)生以及睪丸發(fā)育是通過(guò)旁分泌和自分泌的形式進(jìn)行的，而且對(duì)維持生精小管的結(jié)構(gòu)與功能也起著關(guān)鍵的作用[19]。在睪丸組織中，TGF-β1調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的激素分泌功能、管周肌樣細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)、睪丸發(fā)育及精子發(fā)生[20]。生精小管示意圖(見圖2)。

2.1 TGF-β1對(duì)支持細(xì)胞的作用 支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)位于生精小管內(nèi)皮，它是組成生精上皮的極其關(guān)鍵成分，它的細(xì)胞基部與生精上皮的基底相互連接，頂部可伸長(zhǎng)至腔面。Sertoli細(xì)胞的數(shù)量決定了雄性生殖細(xì)胞的產(chǎn)量，每個(gè)支持細(xì)胞支持固定數(shù)量的生殖細(xì)胞[21]，也能將精子形成過(guò)程中產(chǎn)生并被遺棄的胞質(zhì)殘余部分進(jìn)行吞噬與清除，位于Sertoli細(xì)胞間的重要結(jié)構(gòu)，即：緊密連接(TJ)，主要由相連的支持細(xì)胞形成，直接參與血-睪屏障(blood-testis barrier， BTB)的構(gòu)成[22]，BTB能夠?qū)⒁恍┯卸居泻ξ镔|(zhì)隔離在生精小管外部，防止其進(jìn)出生精上皮而產(chǎn)生精子抗原，避免啟動(dòng)體內(nèi)免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生自身免疫反應(yīng),因此為生精細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育、成熟建立了一個(gè)相對(duì)安全且穩(wěn)定的微環(huán)境[23]，同時(shí)提供必須的營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)支持，TGF-β1對(duì)大鼠支持細(xì)胞增殖、分化、凋亡及緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)也具有促進(jìn)作用[24]。

支持細(xì)胞一直被描述為精子發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞[25-26]，睪丸支持細(xì)胞是TGF-β1作用的靶細(xì)胞[27]，TGF-β1在調(diào)節(jié)未成熟睪丸細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)時(shí)間-濃度依賴性，表明TGF-β1與正常生精上皮發(fā)育是有密切關(guān)系的，Sertoli細(xì)胞被卵泡刺激素(FSH)作用后，在功能上呈劑量依賴性。加入TGF-β1后則降低了它的促性腺激素的作用[28]，TGF-β1能夠明顯減少Sertoli細(xì)胞中FSH誘導(dǎo)的cAMP水平[29-31]，Sertoli細(xì)胞TGF-β1調(diào)節(jié)的機(jī)制遠(yuǎn)比最初想象的復(fù)雜，支持細(xì)胞中的TGF-β1水平的減少，能夠阻礙生殖細(xì)胞發(fā)育[32]。胚胎期支持細(xì)胞中SMAD4的缺失,可以抑制精小管索的形成，導(dǎo)致胚胎期睪丸索發(fā)育不全和成年期輕度睪丸發(fā)育不全，如睪丸變小、部分生精小管發(fā)育不全、精子產(chǎn)生量低等疾病的發(fā)生[33-34]。進(jìn)一步的研究則需要從遺傳模型來(lái)揭示TGF-β1信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育的完整性和形態(tài)學(xué)的機(jī)制進(jìn)行研究。

支持細(xì)胞 (Sertoli cell,SC )；生殖細(xì)胞(Germ cell， GC)；管周肌樣細(xì)胞( Peritubular myoid cell,PTM)；睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell,LC)；TGF-β1可以促進(jìn)SC cells增殖、分化、凋亡及緊密連接相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)；TGF-β1對(duì)性腺發(fā)育中GC具有促進(jìn)作用；TGF-β1對(duì)LC調(diào)節(jié)雄性激素水平有作用；TGF-β1可以促進(jìn)PTM cells對(duì)曲細(xì)精管基底層的調(diào)節(jié)。圖2 生精小管結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 TGF-β1對(duì)管周肌樣細(xì)胞的作用 管周肌樣細(xì)胞(PTM)定位于內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)腔側(cè)和外膜成纖維細(xì)胞的腔側(cè)，分別覆蓋著不同的小血管和大血管[1]，并且沿著血管形成。超微結(jié)構(gòu)研究表明，管周肌樣細(xì)胞缺乏致密體，而且肌絲較少，通過(guò)TGF-β1對(duì)PTM細(xì)胞增殖和DNA合成H-脫氧胸腺嘧啶攝入的實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1雖然不能促進(jìn)管周肌樣細(xì)胞的增殖，但可通過(guò)抑制TGF-β1引起管周肌樣細(xì)胞DNA的合成，此外，TGF-β1主要通過(guò)Ⅰ型受體的介導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extra-cellular matrix，ECM)沉積[35]，從而來(lái)激活PTM的 PAI-1(plasminogen activator inhibiter-1)。管周肌樣細(xì)胞分泌的 PAI-1 與支持細(xì)胞分泌的 PA(plasminogen activator)發(fā)揮協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)血睪屏障的形成和功能。TGF-β1也可通過(guò)對(duì)管周肌樣細(xì)胞的刺激來(lái)增加功能蛋白的產(chǎn)生，包括蛋白聚糖、膠原蛋白以及纖粘連蛋白。其能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)，并且這些物質(zhì)是構(gòu)成基底膜的關(guān)鍵構(gòu)成組分，由此可以說(shuō)明TGF-β1能夠參與、調(diào)節(jié)管周肌樣細(xì)胞對(duì)曲細(xì)精管基底層的作用[36]。

2.3 TGF-β1對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用 睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig 細(xì)胞)的主要作用就是調(diào)節(jié)雄性激素水平，大約98%的雄性激素都是間質(zhì)細(xì)胞所調(diào)控的。雄性激素的產(chǎn)生不僅取決于間質(zhì)細(xì)胞的功能，而且還取決于間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。在大鼠中，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中可以分為四個(gè)階段：干細(xì)胞(在整個(gè)生命周期內(nèi))、祖細(xì)胞(在出生后第21天)、未成熟細(xì)胞(在出生后第28～35天)和成年間質(zhì)細(xì)胞(在出生后第56天之后)[37]。哺乳動(dòng)物睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分化從胚胎期11.5 d開始，這也需要TGF-β1信號(hào)通路的調(diào)控。利用顯微注射技術(shù)將TGF-β1受體抑制劑注射入模型大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)，可以有效阻斷TGF-β1在模型大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)[38-39]，同時(shí)抑制劑明顯減少了大鼠精子密度和降低了精子活力以及快速前向運(yùn)動(dòng)精子率(A級(jí))、快速運(yùn)動(dòng)精子率(B級(jí))，并且在高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，抑制劑組模型大鼠睪丸TGF-β1表達(dá)減少，精子生成的數(shù)量減少，TGF-β1受體表達(dá)可以提高精子質(zhì)量，同時(shí)也能夠增加血清性激素水平[40]，TGF-β1可以調(diào)節(jié)成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞雌二醇(E2)的合成[39]。TGF-β1在衰老圓形精子細(xì)胞中的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。出生35天小鼠中Leydig細(xì)胞表達(dá)TGF-β1較弱，而出生50天Leydig細(xì)胞TGF-β1表達(dá)較強(qiáng)，出生75天間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)下降。在Leydig細(xì)胞中，TGF-β1依賴于信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的I型受體發(fā)揮刺激和抑制作用[41]，其在小鼠睪丸功能和生殖細(xì)胞發(fā)育中起重要作用[42]。TGF-β1同時(shí)也參與了睪丸間質(zhì)細(xì)胞周期的調(diào)控，在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，TGF-β1與孕酮協(xié)同作用可促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中低劑量的TGF-β1與孕酮協(xié)同參與了睪丸間質(zhì)細(xì)胞肥大、增生的過(guò)程，因此TGF-β1的表達(dá)與一些男性不育的睪丸病理疾病密切相關(guān)，如：精子生成不足，就與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增生和肥大有關(guān)[43-44]。

哺乳動(dòng)物睪丸間質(zhì)細(xì)胞在分泌生長(zhǎng)因子和激素方面起著重要作用，也在促進(jìn)睪丸生殖功能和調(diào)節(jié)睪丸局部微環(huán)境具有關(guān)鍵性作用，睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的睪丸激素對(duì)男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和維持男性一生的生殖功能至關(guān)重要，成人睪酮缺乏導(dǎo)致的癥狀包括對(duì)情緒障礙相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，體脂增加和疲勞，以及肌肉質(zhì)量、認(rèn)知功能和免疫反應(yīng)減少，睪酮也具有抗抑郁和抗焦慮作用，睪酮水平較低與嚴(yán)重抑郁障礙的患病率增加有關(guān),睪酮治療還可能增加心血管并發(fā)癥、睡眠呼吸暫停、紅細(xì)胞增多癥和前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[45-46]，低睪酮的臨床表現(xiàn)包括性欲喪失、勃起功能障礙和繼發(fā)性特征改變[47]。睪酮的合成量與黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(HCG)的量呈正相關(guān)。TGF-β1介導(dǎo)了未成熟的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的LH的生成量，將TGF-β1加入到胚胎期小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，可使睪酮的基礎(chǔ)產(chǎn)量減少，同時(shí) LH 誘導(dǎo)產(chǎn)生的睪酮量也降低[48]。TGF-β1對(duì)豬和大鼠原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮含量影響的研究，發(fā)現(xiàn)睪酮合成的抑制作用主要發(fā)生在細(xì)胞膜上，并且可以抑制LH與HGG 誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)生 ，同時(shí)抑制 cAMP介導(dǎo)的睪酮生物合成。而且TGF-β1可以通過(guò)抑制睪酮的分泌來(lái)影響類固醇合成，能夠抑制 Leydig 細(xì)胞的增殖，此外還參與調(diào)控 Leydig 細(xì)胞由未成熟狀態(tài)向成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變的細(xì)胞分化過(guò)程，是其對(duì)睪丸 Leydig 細(xì)胞功能調(diào)控的一種重要機(jī)制。

2.4 TGF-β1對(duì)其他細(xì)胞的作用 TGF-β1 是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)控因子，也是代表性的抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[49-50]。在前列腺癌組織中，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌 TGF-β1，導(dǎo)致免疫細(xì)胞抑制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生[51]。在睪丸局部感染時(shí)，通過(guò)改變TGF-β1分泌的量和作用方式，來(lái)調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞使其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。TGF-β1通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明在性別特異性生殖系的分化中起作用[52]。睪丸間質(zhì)主要包括睪丸間質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞[53]。形態(tài)學(xué)分析表明 TGF-β1也表達(dá)于睪丸間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌TGF-β1參與睪丸免疫微環(huán)境及正常生精的調(diào)控[54]。TGF-β1在精子頂體后區(qū)、頸部及尾中部均有所表達(dá)[55-56]。TGF-β1對(duì)睪丸細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[57]。TGF-β1敲除小鼠睪丸生殖細(xì)胞數(shù)量減少，因其在性腺發(fā)育中對(duì)生殖細(xì)胞具有一定作用且TGF-β1對(duì)睪丸生殖細(xì)胞瘤與精子減少癥具有影響[58-59]，當(dāng)TGF-β1表達(dá)異常是可致睪丸損傷,影響雄性發(fā)育功能[60]。

3 展望

TGF-β1在生理和病理過(guò)程中必不可少，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮功能，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、傷口愈合、纖維化、炎癥以及組織的發(fā)育、分化和修復(fù)等均受TGF-β1調(diào)控[61-62]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，TGF-β1與人類眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它與睪丸形成和精子發(fā)生異常的各種疾病相關(guān)，包括不孕癥、性發(fā)育障礙和睪丸發(fā)育不全綜合癥的易感性TGF-β1信號(hào)通路調(diào)控。因此，闡明 TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)通路在睪丸發(fā)育及精子形成中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，有助于不孕不育診斷、嚴(yán)重程度判斷和預(yù)后評(píng)估，并成為其潛在的治療靶點(diǎn)。我們課題組在三維立體培養(yǎng)體系中可以選擇TGF-β家族受體抑制劑(SB431542、Alk5 inhibitor)進(jìn)行研究TGF-β信號(hào)通路中的smad2,smad3以及smad5分子之間的關(guān)系。目前缺乏可以阻止或逆轉(zhuǎn)睪丸生殖疾病進(jìn)展的有效治療方法。提高對(duì)TGF-β1信號(hào)通路分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，亦將有助于發(fā)現(xiàn)生殖疾病治療的新策略。