鄧 玲，彭波輝，彭 昌

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 小兒內科，貴州 遵義 563099)

臨床研究及動物實驗證實，心肌肥厚是多種心臟疾患發(fā)生、發(fā)展過程中的一個重要階段，是誘發(fā)患者心衰及心源性猝死的重要原因之一[1-4]。而目前針對該病的預防及治療措施均不完善，且有一定的局限性，療效不顯著。因此，尋求針對心肌肥厚更為理想的防治措施成為亟待解決的重要課題。組蛋白修飾作為表觀遺傳學的重要修飾方式之一，受組蛋白乙?；?Histone acetylases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)調控，并在心肌肥厚過程中起著重要作用[5-6]。綠茶以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(ECCG)為其主要成分，含量最高，活性最強，具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、降壓降糖、防齲齒等多種生物學效應[7-8]。有研究報道，EGCG在表觀遺傳調控中發(fā)揮了重要調控作用，如通過抑制經典Ⅰ類HDACs參與基因的表達與調控[9]，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。但EGCG是否是能通過調控HDAC改善小鼠心肌肥厚國內外報道相對少見。因此，本研究將采用苯腎上腺素誘導小鼠心肌細胞肥大來探討EGCG在該病理生理過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 所有的實驗動物均由陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2017-0015。100只清潔級健康新生昆明小鼠，出生1～3 d，雌雄不限。

1.2 主要試劑與儀器 細胞裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司；超敏發(fā)光液購自賽默飛；PVDF膜購自 Merck Millipore公司；兔抗GATA4、ANP、β-MHC、HDAC2及GAPDH多克隆抗體及其檢測試劑盒(檢測限：5～200 ng/mL)均購自美國Abcam公司；EGCG(純度95%)購自美國Sigma公司；抗Alexa Flour 488熒光標記山羊抗小鼠IgG熒光二抗購自中杉金橋生物技術有限公司；抗α- actin及HRP標記二抗購自Proteintech公司；熒光定量PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；HDAC2活性檢測試劑盒購自GenMed公司；Chemi DocTM XRS + 超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)、CFX Connect[TM]實時熒光PCR儀購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；UV-1600PC型紫外分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司。

1.3 小鼠心肌細胞的分離及鑒定 二氧化碳麻醉處死實驗小鼠，取其左心室組織，PBS 清洗、充分剪碎后待測。以0.25 %胰蛋白酶及1 mg/mL Ⅱ型膠原酶混合消化分離心肌細胞，90 min差速貼壁分離純化心肌細胞，加入終濃度為0.1 mmol/L Brd U抑制非心肌細胞的生長以提高心肌細胞純度。倒置顯微鏡下觀察不同時間心肌細胞形態(tài)學變化；記錄心肌細胞搏動頻率；臺盼藍染色，測定心肌細胞存活率。并利用心肌細胞特異性表達α-肌動蛋白的特性運用免疫細胞化學染色方法鑒定心肌細胞。

1.4 細胞分組 將1.3獲得的小鼠心肌細胞隨機分為正常組、PE組、溶媒組、EGCG組，除正常組外，其余三組均造模成功后待測。具體操作：將心肌細胞置于無血清DF培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，換為含10 % FBS的DF培養(yǎng)5 h，然后加入濃度為100 μmol/L PE(PE組)，或1.0 %DMSO+100 μmol/L PE(溶媒組)，或100 μmol/L PE +10 μmol/L EGCG(EGCG組)，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.5 免疫熒光技術檢測小鼠心肌細胞表面積 按1.4分組培養(yǎng)細胞，制作細胞爬片，4 %多聚甲醛固定15 min， PBS中漂洗，5 min × 4次，0.3 % Triton-100室溫孵育30 min，PBS漂洗，5 min × 4次，血清室溫封閉30 min，抗α-actin(1∶50)4 ℃過夜，PBS中漂洗，5 min × 3次，加Alexa Flour488熒光標記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶1 000)，避光室溫1.5 h，PBS中漂洗，5 min × 4次，DAPT染核5 min，PBS中漂洗，5 min × 4次,封片劑封片，濾紙吸取多余水分，避光4 ℃保存，盡快拍照，顯微鏡下，每組隨機選擇5個視野，進行拍照處理，每個視野隨機選取20個細胞，用美國Image Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件測定細胞表面積，取其平均值。

1.6 比色法檢測HDAC2活性 按1.4分組培養(yǎng)細胞，并收集細胞，在HDAC2試劑盒說明書指導下測定小鼠心肌細胞中HDAC2活性。

1.7 Western blot檢測細胞中HDAC2、GATA4、ANP、β-MHC蛋白表達 按1.4分組培養(yǎng)細胞，收集細胞并裂解得到細胞總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣后，進行凝膠電泳，濕法轉PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，兔來源單克隆抗體ANP(1∶1 000) ，抗GATA4兔多克隆抗體(1∶5 000)，抗HDAC2兔單克隆抗體(1∶2 000)，抗β-MHC兔單克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育，HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌6次，每次5 min，化學發(fā)光試劑發(fā)光顯影，采用Bio-Rad圖像分析儀進行圖像掃描；應用Quantity One 4.4軟件進行分析。

1.8 RT-PCR 檢測心肌細胞GATA4的基因表達水平 針對GATA4核心編碼區(qū)設計特異性引物，用Primer Premier 5.0軟件設計，由寶生物公司合成。將GATA4基因產物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴增,做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。GATA4上游引物序列為5’- CACTAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ ,下游引物序列為5’-CTTCAGAGCAGACAG-CACTGGATG -3’，產物大小為154 bp，反應條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，所得數(shù)據(jù)用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件處理。

2 結果

2.1 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞中HDAC2蛋白表達量及活性的影響 與正常組比較，PE組及溶媒組中HDAC2蛋白表達量及活性均升高(P<0.01)；與PE組及溶媒組比較，EGCG組中HDAC2蛋白表達量及活性均降低(P<0.01,見圖1)。

*：與正常組比較，P< 0.01；#：與PE及溶媒組比較，P<0.01，n=3。圖1 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞HDAC2蛋白表達及活性的影響

2.2 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞中GATA4蛋白及mRNA表達量的影響 與正常組比較，PE組及溶媒組中GATA4蛋白及mRNA表達量均上調(P<0.01)；與PE組及溶媒組組比較，EGCG組中GATA4蛋白及mRNA表達量均下調(P<0.01,見圖2)。

2.3 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞中ANP、β-MHC蛋白表達量的影響 與正常組比較，PE組及溶媒組中心肌肥大標記物ANP、β-MHC蛋白表達量上調(P<0.01)；與PE組及溶媒組比較，EGCG組心肌細胞肥大標記物ANP、β-MHC蛋白表達量下調(P<0.01,見圖3)。

2.4 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞表面積的影響 與正常組比較，PE組及溶媒組心肌細胞表面積增加(P<0.01)；與PE組及溶媒組比較，EGCG組心肌細胞表面積減少(P<0.01，見圖4)。

*：與正常組比較，P<0.01；#：與PE及溶媒組比較，P<0.01，n=3。圖2 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞GATA4 mRNA和蛋白表達的影響

*：與正常組比較，P<0.01；#：與PE及溶媒組比較，P<0.01，n=3。圖3 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞ANP、β-MHC蛋白表達的影響

*：與正常組比較，P<0.01；#：與PE及溶媒組比較，P<0.01，n=3。圖4 EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞表面積的影響

3 討論

心肌細胞肥大是引發(fā)心血管疾病的獨立高危險因素?；颊叱霈F(xiàn)心肌肥厚時，其心肌細胞表型出現(xiàn)明顯變化，例如細胞體積增大、心房利鈉肽(ANP) 、β-心肌肌球蛋白重鏈(β-MHC)等胚胎期基因表達過程改變等[10]。

組蛋白修飾作為表觀遺傳修飾之一包括組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等。研究發(fā)現(xiàn)，HDACs介導的組蛋白乙?；揎椩诓±硇孕募》屎瘛⒌蛲?、壞死及纖維化所致的心肌重塑中扮演了重要角色[11]，HDAC2可以調節(jié)心肌肥厚的下游靶點KLF4，KLF4通過抑制心房利鈉肽前體表達從而逆轉心肌肥厚，用HDAC2基因敲除鼠已經證實了HDAC2參與了心肌肥厚的調控，為應用HDAC2抑制劑EGCG對心肌肥厚進行調控提供了理論依據(jù)[12]，但具體調控機制仍不十分清楚。

有研究報道，EGCG具有表觀遺傳調控作用，如抑制DNA甲基化轉移酶，并且可以通過抑制Ⅰ類HDACs參與基因的表達與調控[13]。EGCG能調節(jié)HDAC2的活性，磷酸化HDAC2(p-HDAC-2)蛋白表達量顯著下降[14]。進而提示EGCG在干預心血管疾病方面有重要的科學研究價值，其作用機制尚需進一步闡明。

GATA是鋅轉錄因子家族的一員，是心肌基因表達重要的調控因子，參與了心臟發(fā)育、功能基因表達及心肌肥厚的全過程。研究發(fā)現(xiàn)GATA4羧基端具有心臟肥厚特異性表達基因的功能性結合位點，心臟特異性高表達GATA4，進而促進ANP、β-MHC等心肌肥厚特異性基因表達，致使心肌肥厚產生[15]。有研究證實，HDACs及其抑制劑能夠調控心臟相關轉錄因子的表達，進而調節(jié)心肌細胞肥厚的發(fā)生發(fā)展[16]。

因此本研究首先采用酶消化法獲得小鼠心肌細胞，并利用PE誘導小鼠心肌細胞進而復制體外心肌細胞肥大模型，接著采用Western blot、比色法及CHIP-qPCR等實驗方法來探討EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞中HDAC2蛋白表達量、活性的影響，體外細胞實驗結果與本課題組前期在動物實驗中的研究結果一致[6]：PE組及溶媒組中HDAC2蛋白表達量、活性均顯著提高，而EGCG的干預，能顯著的抑制這種變化，提示EGCG可能通過調控HDAC2進而改善小鼠心肌細胞肥大。本研究進一步的探討EGCG對PE誘導的小鼠心肌細胞肥大中GATA4、ANP、β-MHC表達量及心肌細胞表面積的影響，結果表明EGCG的干預能顯著下調PE誘導的小鼠心肌細胞中GATA4、ANP、β-MHC的表達水平，并減少心肌細胞表面積從而改善心肌細胞肥大。

綜上所述，EGCG能顯著影響PE誘導的小鼠心肌細胞中GATA4蛋白及mRNA表達水平及ANP、β-MHC蛋白表達，抑制小鼠心肌細胞肥大，此過程可能與EGCG調控HDAC2表達相關，但具體的調控機制仍需更多的研究進一步證實。