周 俊，袁 丹，劉蒙蒙，鐘 櫟，劉俊江，孫小杰，周正平

(1.遵義醫(yī)科大學 病理學教研室，貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)科大學 電鏡室,貴州 遵義 563099)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial carcinoma)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一， 2018年國際癌癥研究機構統(tǒng)計全球約有382 069例新發(fā)病例和89 929例死亡病例，其高發(fā)病率和高死亡率，嚴重威脅女性健康[1-2]。子宮內(nèi)膜癌以Ⅰ型(雌激素依賴型)多見，其主要組織學類型是子宮內(nèi)膜樣癌(Endometrioid carcinoma,EC)，雌激素受體(Estrogen receptor,ER)多呈陽性表達，根據(jù)分化程度EC可分為高、中、低分化3種[3-4]。在EC發(fā)生發(fā)展的過程中，長期無孕激素拮抗的高雌激素環(huán)境是最主要的高危因素，細胞周期(Cell cycle)異常調(diào)控可能也參與了這個過程，p57kip2屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI)中的CIP/KIP家族，在細胞周期調(diào)節(jié)機制中起負性調(diào)控作用，使細胞無法從G1期轉變到S期，從而抑制細胞增殖[5-6]。本實驗采用不同濃度雌二醇(β-Estradiol，E2)分別干擾兩種不同分化的人EC細胞，探討雌激素、細胞周期調(diào)控與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人EC高分化的Ishikawa細胞株購于南京凱基公司，人EC 中分化的JEC細胞株由遵義醫(yī)科大學微生物教研室提供。

1．2 試劑與儀器 E2購于Sigma公司，p57kip2鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司；β-actin鼠抗人單克隆抗體購自上海生工生物工程有限公司；二抗山羊抗鼠抗體購自美國LI-COR公司；Western blot檢測試劑購自上海碧云天公司。酶標儀(美國Thermo scientific公司)；倒置顯微鏡CKX41(日本OLYMPUS公司)；透射電子顯微鏡H-7650(日本日立公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組 將RPMI 1640培養(yǎng)基、南美胎牛血清和100 U/mL雙抗按90%、10%和1%的比例配制成完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下體外培養(yǎng)人Ishikawa細胞和JEC細胞。加等量含低、中、高濃度E2(10-6、10-8、10-10mol/L)的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)兩株人EC細胞作為實驗組，等量不含E2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照組。

1.3.2 MTT法檢測兩株細胞的生長情況 取對數(shù)生長期細胞制成1×105個/mL的單細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板上，待細胞貼壁后，將兩組細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，PBS沖洗每孔，加20 μL、5 mg/mL MTT溶液，至孵箱反應4 h后吸出MTT溶液，加100 μL /孔二甲基亞砜(DMSO)，避光震蕩10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測各組的吸光光度值(OD值)。

1.3.3 倒置顯微鏡觀察兩株細胞形態(tài)結構 取對數(shù)生長期細胞制備成1×106個/mL的單細胞懸液，按接種于6孔板上，待細胞貼壁，將兩組細胞分別培養(yǎng)24、72 h后于倒置顯微鏡下觀察。

1.3.4 透射電鏡觀察細胞超微結構 將兩組細胞分別培養(yǎng)24、72 h后，消化、離心，將細胞團塊轉移到2.5%戊二醛固定液中前固定，1%四氧化鋨后固定，乙醇、丙酮梯度脫水，浸透，Epon812樹脂包埋、聚合，半薄切片定位、超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.5 Western blot檢測兩株細胞P57kip2蛋白水平 將兩組細胞分別培養(yǎng)24、72 h，加裂解液至冰上裂解30 min，提取蛋白后用BCA法測蛋白濃度，根據(jù)試劑說明書配置合適的分離膠和濃縮膠，5×上樣緩沖液：蛋白按1∶4的比例混勻后沸水煮3～5 min，進行上樣、電泳，切下p57kip2蛋白分子量大小所在區(qū)域的凝膠轉膜、封閉，一抗(稀釋相應倍數(shù)的β-actin、p57kip2鼠抗人單克隆抗體)4℃搖床孵育過夜，洗膜3次，二抗(稀釋相應倍數(shù)的山羊抗鼠抗體)室溫搖床孵育2 h，洗膜3次，于Odyssey系統(tǒng)掃描成像，檢測目的蛋白的相對含量(P57kip2灰度值/β-actin灰度值)。

2 結果

2.1 E2干預后Ishikawa和JEC細胞增殖能力變化 相同作用時間：①在Ishikawa細胞中，與對照組對比，低、中濃度E2干擾下細胞均有明顯增殖，隨著時間延長，E2高濃度組與其他各組比較，細胞生長均受到不同程度抑制；除24、72 h中，對照組與E2高濃度組比較差異不大，其余各濃度組之間對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。②在JEC細胞中，隨著E2濃度增高，細胞增殖活力逐漸增強，在48、72 h，E2各濃度組與對照組之間比較，高濃度組與低濃度組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

相同藥物濃度：在Ishikawa和JEC細胞中，隨著E2干擾時間延長，各實驗組細胞均有不同程度增長，且各時間段之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1～2)。

組別24h48h72h對照21.93±1.1626.25±0.8430.99±0.59E2低濃度33.07±1.5237.82±0.2146.72±0.40E2中濃度28.52±1.8034.21±0.4240.51±0.60E2高濃度22.41±0.9621.15±0.3225.19±0.21

組別24h48h72h對照12.46±1.2318.47±0.4228.98±0.46E2低濃度13.00±0.5920.41±1.3231.23±0.89E2中濃度13.35±0.3121.68±1.1532.09±1.03E2高濃度13.46±1.4623.13±0.6933.76±0.91

2.2 E2干預后Ishikawa和JEC細胞形態(tài)變化 光鏡下Ishikawa細胞呈梭形、不規(guī)則形；JEC細胞呈多邊形或不規(guī)則形，可見明顯的圍腺腔樣結構(見圖1A)。隨培養(yǎng)時間延長，低、中濃度E2干預的Ishikawa細胞密度較對照組增大，但高濃度E2干預下細胞密度減小(見圖1)；JEC細胞密度隨E2干預濃度增高而增大。兩組細胞形態(tài)未見明顯改變。

2.3 E2干預后Ishikawa和JEC細胞超微結構變化

2.3.1 對照組 Ishikawa細胞多呈卵圓形，細胞游離面可見少量細而長的微絨毛；細胞內(nèi)部：可見中等數(shù)量、板層狀和管泡狀嵴的線粒體；成層排列的粗面內(nèi)質網(wǎng)，表面可見核糖體附著；偶見次級溶酶體，細胞核大而不規(guī)則，核膜迂曲，部分細胞內(nèi)可見自噬現(xiàn)象(見圖3A)。JEC細胞多呈橢圓形，細胞游離面微絨毛較Ishikawa細胞少；細胞內(nèi)部：線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、次級溶酶體散在分布于胞質內(nèi)，細胞核大，核膜齒狀曲折，核仁明顯、邊集，核內(nèi)可觀察到異染色質，核質比明顯大于Ishikawa細胞，分泌泡豐富(見圖4A)。

2.3.2 低濃度組 Ishikawa細胞微絨毛較對照組增多，可見較多線粒體有輕度腫脹，嵴部分斷裂，核仁肥大、深染，核質比增大(見圖3B)。JEC細胞可見分泌泡減少，染色質邊集，其它細胞結構無明顯變化(見圖4B)。

A：對照組；B：E2低濃度組；C：E2中濃度組；D：E2高濃度組；×100。圖1 不同濃度E2干預Ishikawa細胞72 h后的細胞生長情況

A：對照組；B：E2低濃度組；C：E2中濃度組；D：E2高濃度組；×100。圖2 不同濃度E2干預JEC 細胞72h后的細胞生長情況

2.3.3 中濃度組 Ishikawa細胞微絨毛較對照組減少，線粒體嚴重腫脹、嵴少甚至不可見、外膜破裂，并出現(xiàn)自噬現(xiàn)象和多個內(nèi)質網(wǎng)腫脹，核質比進一步增大(見圖3C)。JEC細胞可見細胞表面微絨毛氣球樣腫脹、融合，胞質內(nèi)分泌泡較對照組明顯減少，出現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)腫脹和較多次級溶酶體，核質較對照組增大，核膜凹陷，形成明顯的核袋，偶見核孔，并有自噬現(xiàn)象(見圖4C)。

2.3.4 高濃度組 Ishikawa細胞微絨毛明顯減少，可見明顯線粒體腫脹、空泡化、線粒體膜破裂，內(nèi)質網(wǎng)增生、擴張囊泡化，并有凋亡小體出現(xiàn)(見圖3D)。JEC細胞部分失去原有細胞形態(tài)，質膜線性中斷，細胞表面微絨毛出現(xiàn)大量氣球樣腫脹，線粒體腫脹，出現(xiàn)絮狀沉積物，可見較多內(nèi)質網(wǎng)腫脹和自噬現(xiàn)象，核內(nèi)染色質均勻化，核孔增多(見圖4D)。提示細胞不可逆性損傷、壞死、退化。

A：對照組(bar=5.0 μm)，分泌泡(□)；B：E2低濃度組(bar=5.0 μm)，分泌泡(□)；C：E2中濃度組(bar=5.0 μm)，核孔(↑)，次級溶酶體(↑↑)；D：E2高濃度組(bar=10.0 μm)，核孔(↑)，次級溶酶體(↑↑)，微絨毛氣球樣腫脹(↑↑↑)，內(nèi)質網(wǎng)腫脹(▲)，染色質均質化(★)。圖4 不同濃度E2干擾JEC細胞72 h后的細胞超微結構

2.4 E2干預后Ishikawa和JEC細胞P57kip2蛋白水平變化 相同作用時間：在Ishikawa細胞，P57kip2蛋白在低濃度E2組表達最低，隨著E2濃度增高，P57kip2蛋白表達逐漸增加(見圖5)，在24 h，P57kip2蛋白在對照組表達最高(見圖6)，在72 h，P57kip2蛋白在E2高濃度組表達最高(見圖7)，在24，72 h中，E2高濃度組與其它組分別比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在JEC細胞中，隨著E2濃度增高，P57kip2蛋白表達逐漸降低；僅在72 h中，3個濃度E2組分別與對照組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

相同藥物濃度：在Ishikawa細胞中，隨著E2干擾時間延長，P57kip2蛋白表達增加，在3個濃度E2組中，24 h和72 h之間分別對比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在JEC細胞中，隨著E2干預時間的延長，P57kip2蛋白表達降低，在E2中、高濃度組，24 h和72 h之間分別比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A、B:Ishikawa細胞各濃度組24、72 h蛋白表達情況；C、D：JEC細胞各濃度組24、72 h蛋白表達情況。圖5 E2各濃度組干擾Ishikawa、JEC細胞24、72 h后P57kip2蛋白的表達情況

★： 與Ishikawa細胞其它組比較，P<0.05。 圖6 不同濃度E2干預Ishikawa和JEC細胞24 h后P57kip2蛋白表達統(tǒng)計

★： 與Ishikawa細胞其他組比較，P<0.05；▲：與JEC細胞其他組比較，P<0.05。 圖7 不同濃度E2干預Ishikawa和JEC細胞72 h后P57kip2蛋白表達統(tǒng)計

3 討論

子宮內(nèi)膜癌為最主要的激素依賴性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展通常與雌激素異常調(diào)控和雌激素誘導的信號傳導相關，E2可通過與ERα和ERβ兩種受體結合，誘導相關靶基因轉錄，從而促進細胞有絲分裂，增加細胞增殖速率，但雌激素對子宮內(nèi)膜癌進展的確切機制目前尚未明確[7-8]。相關研究顯示，在Ishikawa細胞中E2可能通過ATP結合盒轉運蛋白亞家族G2 (ATP-binding cassette transporter sub-family G2,ABCG2)來促進細胞內(nèi)某些物質流出來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境，從而加速細胞惡化，E2還可通過激活IL-6途徑顯著促進Ishikawa和RL95-2細胞的增殖、遷移和侵襲能力[9-11]。在本次實驗中，低、中濃度E2對兩株人EC細胞有不同程度促細胞增殖作用，細胞生長密度有不同程度增大，但是高濃度E2在Ishikawa細胞中是抑制細胞增殖作用，細胞生長密度減小；在JEC細胞中則是明顯促進細胞增殖作用，細胞生長率持續(xù)上升，細胞生長密度明顯增加。在TEM結果中，未加E2干擾的兩株EC細胞，主要表現(xiàn)為細胞代謝旺盛、功能活躍；隨著E2干預濃度增高、時間延長，72 h后兩株EC細胞均出現(xiàn)不同程度的細胞超微結構損傷和退化：①低濃度E2干擾后的兩株細胞均表現(xiàn)為蛋白合成功能增強的代償性形態(tài)結構改變，伴隨輕微可逆性細胞損傷；②中濃度E2干擾后，Ishikawa細胞中核質比明顯增大，提示細胞代謝增加，惡性增強，并出現(xiàn)了線粒體外膜破裂這樣的不可逆性超微結構損傷；JEC細胞出現(xiàn)損傷加重，但為可逆性，核袋、核孔的出現(xiàn)，核質比增大，次級溶酶體增多，以及分泌泡的減少提示著細胞代謝更加旺盛、惡性程度增加；③高濃度E2干擾后，Ishikawa細胞中內(nèi)質網(wǎng)擴張囊泡化，并出現(xiàn)凋亡小體，提示細胞出現(xiàn)功能障礙，細胞損傷嚴重；JEC細胞中線粒體高度腫脹并出現(xiàn)絮狀沉積物，核內(nèi)染色質均勻化，核孔增多，提示著細胞出現(xiàn)不可逆性損傷、核壞死。由此可見，E2在促進EC細胞增殖的同時，還可能使EC細胞惡性度增強。

p57kip2是最遲被發(fā)現(xiàn)并克隆的細胞周期抑制基因，位于染色體11p15.5，其編碼的蛋白質相對分子量為57 kDa，由316個氨基酸構成。有文獻報道，P57kip2蛋白在淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等組織中的表達均明顯下調(diào)，其表達水平越低，預示著腫瘤的分化程度越低、臨床分期越晚、淋巴結轉移率越高、預后越差。因此，p57kip2被認為是一種候選的腫瘤抑制基因[12-17]。在本次實驗中，P57kip2蛋白在人EC Ishikawa和JEC細胞中的表達不一樣：在Ishikawa細胞中，P57kip2蛋白在低、中濃度E2組表達較對照組低，干預72 h后高濃度E2組表達最高，隨著E2濃度由低到高，P57kip2蛋白表達明顯依次增高，使細胞停滯于S期，細胞生長由開始的促進作用轉變?yōu)橐种?；在JEC細胞中，P57kip2蛋白在各濃度E2組中表達較對照組逐漸減小，整體變化趨勢不明顯，P57kip2蛋白表達下調(diào)，抑制其負向調(diào)控細胞周期的作用，導致細胞惡性生長。在相同作用時間、相同濃度E2干預下，P57kip2蛋白表達在Ishikawa細胞中均明顯高于JEC細胞；提示，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展中，不同分化的EC細胞對E2干預的敏感性可能不同，在相同激素水平干擾下，EC分化程度越低，P57kip2蛋白表達越低，腫瘤細胞DNA合成紊亂、生長失控，進一步反映出EC細胞的增殖分化情況及惡性行為。

綜上所述，在EC發(fā)展、分化的過程中，隨著E2濃度的增高，P57kip2蛋白在Ishikawa細胞中表達逐漸升高，從而抑制細胞生長；在JEC細胞中表達逐漸降低，使細胞周期負向調(diào)控減弱，促進EC細胞生長。較高濃度E2破壞EC細胞的正常形態(tài)結構，并造成不可逆性損傷，可能誘導EC細胞往更差方向發(fā)展。