曾 瑤，陸安靜，譚道鵬，秦 琳，杜藝玫， 楊夢婷，姜 媛， 魯艷柳，何芋岐,

(1.遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

石斛是傳統(tǒng)名貴中藥材，最早記載于《神農本草經》，歷代本草及《中國藥典》均有收錄，其藥材來源為蘭科石斛屬多種植物，如金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLidl.)及流蘇石斛(D.fimbriatumHook)等同屬近似種。并且自2010年版《中國藥典》起將鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)單列[1]。石斛類藥材的基源復雜主要是由于石斛類植物的自然環(huán)境繁育能力較弱，加之人類長期的采挖，自然界中主流藥用石斛(如金釵石斛、鐵皮石斛等)野生品已經瀕臨滅絕；另外，石斛屬形態(tài)近似種繁多，分布廣泛，為地方用藥就地取材代用提供了方便。但自2004年國家“十五”科技攻關項目-名貴珍稀藥用植物“鐵皮石斛”的工廠化高產栽培技術獲得重大突破后，帶動了全國范圍內石斛類藥材，尤其是鐵皮石斛的種植熱潮。并且種植方式也由最初的大棚栽培發(fā)展為：大棚栽培[2]、附石栽培[3]和附樹栽培[4]等三種主要栽培模式共存，大棚栽培是采用溫室以樹皮或木屑作為主要栽培基質的工業(yè)化程度最高、產量最高、最為成熟的鐵皮石斛栽培模式；附石栽培是仿照野生鐵皮石斛自然生長條件，以苔蘚作為生長基質，附生在巖石上的一種栽培方式；附樹栽培是仿照野生環(huán)境，將鐵皮石斛捆綁在附生樹種上的栽培方式。歷代本草認為石斛的品質與生長環(huán)境密切相關，自古有“石斛”和“木斛”之分，附石生長者稱之為“石斛”，附樹生長者稱之為“木斛”，并且認為“木斛”品質較差，不堪用[5]。2015版《中國藥典》以多糖含量作為鐵皮石斛藥材主要質量控制指標，對于不同栽培方式中鐵皮石斛多糖含量已有部分報道，如：郭英英等[6]考察了浙江雁蕩山地區(qū)不同附生樹種對鐵皮石斛中多糖的影響，結果表明不同附生樹種鐵皮石斛多糖含量具有顯著差異；張寧南等[7]對比研究了花盆基質、水泥樁、竹片及4種附生樹種栽培鐵皮石斛中的多糖含量，結果發(fā)現附生在檀香、降香檀香、馬占相思樹上的鐵皮石斛石斛多糖含量較高。以上報道說明不同栽培環(huán)境下鐵皮石斛多糖含量存在一定差異，但自古認為附石生長的石斛品質最良，但與其它栽培方式多糖含量的對比研究未見報道。

貴州是最早開展石斛人工栽培的省份之一，貴州省高度重視石斛產業(yè)的發(fā)展，將其列為農村產業(yè)革命重點產業(yè)之一，先后出臺了《貴州省農村產業(yè)革命石斛產業(yè)發(fā)展推進方案(2019-2021年)》、《發(fā)展石斛產業(yè)助推脫貧攻堅三年行動方案》等實施方案，目標將推動貴州省石斛種植規(guī)模達到20萬畝，2018年底已完成種植面積11.3萬畝，主要以附樹及附石仿野生栽培為主。因此，本文以貴州大棚、附石及附樹三種栽培模式鐵皮石斛為對象，對比分析其多糖含量，為今后鐵皮石斛的栽培及質量控制提供數據參考。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料 鐵皮石斛樣品于2018年10月采自貴州省興義市安龍縣西城秀樹農林有限責任公司、貴州首草健康發(fā)展有限公司鐵皮石斛種植基地2年生植株，經鑒定為鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)。

表1 鐵皮石斛樣品來源

編號栽培方式/附生樹種海拔來源XYDO01～03大棚栽培低海拔首草健康XYDO04～12附石栽培高、中、低海拔首草健康XYDO13～21木荷Schimasuperba高、中、低海拔西城秀樹XYDO22～30板栗Castaneamollissima高、中海拔西城秀樹XYDO31～36青杠Quercusacutissima高、中、低海拔西城秀樹

1.2 儀器與試劑 Spectra Max Plus 384全波長酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司);TD5A-WS多管架臺式離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);無水葡萄糖標準品(批號：110833-200904，中國食品藥品檢定院);無水乙醇(批號：20190508，成都金山化學試劑有限公司);苯酚(批號：2014012202，成都科倫化工試劑廠);濃硫酸(批號：20130529，國藥集團化學試劑有限公司);水為蒸餾水。

2 方法

2.1 樣品干燥 將采集的新鮮鐵皮石斛樣品去葉后，切段，置于50℃烘箱中烘干，粉碎，過三號篩，保存待用。

2.2 標準曲線的制備 稱取無水葡萄糖對照品，制備為150 μg/mL的標準儲備液。再取標準儲備液稀釋成0、30、60、90、120、150 μg/mL的系列標準溶液，精密量取1 mL各系列標準溶液，參照《中國藥典》(2015 版，一部)中鐵皮石斛質量標準中標準曲線繪制方法，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.002 8X+0.067 7，R2=0.999 5，結果表明葡萄糖濃度在0～150 μg/mL 范圍內線性關系良好(見圖1)。

2.3 多糖的提取及含量測定 參照《中國藥典》(2015 版，一部)中鐵皮石斛質量標準中的多糖提取及含量測定方法，精密稱取鐵皮石斛樣本0.3 g，加200 mL水加熱回流2 h，離心取上清，精密取2 mL上清液加10 mL無水乙醇在4℃放置1 h，離心，棄去上清，加80%乙醇 8 mL洗滌沉淀，離心棄去上清，重復1次。將沉淀用熱水溶解，放冷定容至25 mL，即為待測樣本。取待測樣本加5%苯酚和濃硫酸進行苯酚硫酸顯色反應，測定各樣品吸光度值，并以標準曲線方程及樣品配制濃度計算出鐵皮石斛樣品中的多糖含量。

圖1 無水葡萄糖標準曲線

3 結果

3.1 各栽培條件下鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析 采用R語言，以多糖含量為縱坐標，高、中、低三個海拔為橫坐標，依36份鐵皮石斛樣品多糖含量分布在坐標象限內，觀察不同樣品多糖含量達標情況(如圖2中黑線為《中國藥典》鐵皮石斛多糖含量25.0%標準限)，結果顯示，鐵皮石斛多糖含量受海拔因素影響明顯，低海拔多糖含量達標率明顯高于中、高海拔。其中高海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為42.10%、最小值為11.00%、平均值為21.83%；中海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為60.00%、最小值為7.90%、平均值為27.28%；低海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為57.40%、最小值18.50%、平均值為35.70%。

3.2 不同海拔條件下整體鐵皮石斛樣品多糖含量差異 根據整體可視化分析情況，進一步對不同海拔條件下鐵皮石斛樣品的多糖含量進行統(tǒng)計分析，結果如圖3所示，鐵皮石斛樣品中多糖含量與其生長海拔成負相關，低海拔鐵皮石斛樣品中的多糖含量最高，且與高海拔樣品具有顯著性差異(T=0.0087，P<0.05)。

圖2 鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析圖

圖3 不同海拔鐵皮石斛多糖含量對比

3.3 相同附生方式內不同海拔條件下的鐵皮石斛多糖含量差異 根據整體可視化分析情況，進一步對比相同附生方式不同海拔條件下鐵皮石斛多糖含量，結果如圖4所示，附石栽培及附木荷樹栽培的低海拔鐵皮石斛多糖含量最高，與整體可視化結果一致。附青杠樹低海拔鐵皮石斛多糖含量與中海拔無顯著性差異，但高于高海拔樣品多糖含量。由于大棚栽培基地全部位于山下低海拔地帶，板栗樹在當地低海拔沒有分布，不具可對比條件。

3.4 不同栽培方式鐵皮石斛多糖含量的差異 以附石、附樹、大棚3種栽培方式鐵皮石斛多糖平均含量對比分析不同栽培方式對鐵皮石斛多糖含量的影響，結果如圖5所示，各栽培方式鐵皮石斛多糖含量依次為大棚>附樹>附石，不同附生樹種間鐵皮石斛多糖含量依次為板栗>木荷>青杠。

圖4 各附生方式內不同海拔鐵皮石斛多糖含量對比

圖5 不同栽培方式及附生樹種鐵皮石斛多糖含量差異

4 討論

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為名貴中藥材“石斛”的來源之一，具有益胃生津，滋陰清熱的功效[1]?，F代藥理學研究表明，石斛具有抗腫瘤、改善記憶力、增強免疫力、降血脂、抗氧化等多種藥理活性，其中多糖是其主要活性成分之一[8-11]。由于長期采挖，野生鐵皮石斛已經瀕危滅絕，目前市場上的鐵皮石斛藥材主要來源于大棚栽培、附石栽培和附樹栽培三種栽培方式產品。歷代本草認為石斛的品質與生長環(huán)境密切相關，附石生長者稱之為“石斛”，附樹生長者稱之為“木斛”，且“生石上者良”，“木斛”品質較差，不堪用[5]?？梢?，不同生長方式的鐵皮石斛入藥現象歷來有之，并且古人對不同來源的鐵皮石斛藥效已有說明，但石斛“生石上者良”的論述尚未見有科學依據。2015年版《中國藥典》以多糖含量作為鐵皮石斛質量評價指標，因此，本文采用藥典方法對不同栽培方法鐵皮石斛中的多糖含量進行了對比分析，分別考察了栽培方式、附生樹種、海拔等因素，對目前全國范圍內缺乏統(tǒng)一的種植規(guī)范現狀下的鐵皮石斛藥用質量控制及其規(guī)范化種植具有一定參考價值。

研究結果顯示：不同栽培條件下，鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析結果顯示，鐵皮石斛多糖含量受海拔因素影響最為顯著，低海拔多糖含量顯著高于中、高海拔含量。說明鐵皮石斛仿野生種植中，海拔的因素不容忽視；再結合栽培方式，大棚栽培基地均位于山下低海拔地帶，大棚栽培鐵皮石斛多糖含量最高除受施肥管理影響外，可能還有海拔因素的影響。附石栽培鐵皮石斛多糖含量隨著海拔增高而降低與整體可視化結果一致，但其平均含量低于附樹及大棚栽培，分析主要由于附石栽培受氣候變化影響較大，及其寡營養(yǎng)環(huán)境有關。為提高鐵皮石斛多糖含量，有多種施肥栽培的報道，但根據傳統(tǒng)用藥經驗，附石生長石斛的品質最優(yōu)，而其多糖含量最低，說明在質量達標的前體下，沒必要一味的追求提高鐵皮石斛的多糖含量。