譚道鵬，陸安靜,2，凌 蕾,2，曾 瑤,2，杜藝玫,2，秦 琳,2，孫墅東，王國(guó)虎，何芋岐,2

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；3.貴州省安龍縣西城秀樹(shù)農(nóng)林責(zé)任有限公司，貴州 安龍 562400；4.貴州省安龍縣林業(yè)局，貴州 安龍 562400)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥材“石斛”的主要來(lái)源[1]，具有滋陰清熱、益胃生津等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛還具有降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗衰老及保護(hù)肝損傷等作用[2]。鐵皮石斛在我國(guó)浙江、福建、云南、貴州、廣西、廣東等地區(qū)廣泛種植[3]。其中貴州是鐵皮石斛原產(chǎn)地之一，主要分布在黔南州和黔西南州地區(qū)[4]，并形成了獨(dú)具特色的仿野生附樹(shù)栽培模式。

由于長(zhǎng)期采挖，野生石斛已瀕臨滅絕。為解決石斛藥材的資源問(wèn)題，1958年胡天放首先報(bào)道了霍山石斛的人工栽培[5]，1978年王用平等[6]報(bào)道金釵石斛栽培方法，1986年吳長(zhǎng)亶[7]報(bào)道了石斛的組培繁育技術(shù)，1999年顧慧芬等[8]報(bào)道了鐵皮石斛的人工組織培養(yǎng)及其與多糖含量的關(guān)系，2004年，我國(guó)“十五”科技攻關(guān)項(xiàng)目“名貴珍稀藥用植物鐵皮石斛的工廠化高產(chǎn)栽培技術(shù)”獲得成功，帶動(dòng)起鐵皮石斛的種植熱潮。栽培方式也由盆栽發(fā)展到大棚栽培、仿野生栽培等方式，其中尤以活樹(shù)附生栽培[9-12]最受歡迎。目前鐵皮石斛栽培研究主要集中在栽培技術(shù)方面，對(duì)于不同附生樹(shù)種種植鐵皮石斛藥材的化學(xué)成分、品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面的研究較少，鐵皮石斛中除了多糖[13-15]外，還含有大量的小分子類化學(xué)成分，如酚類、生物堿、聯(lián)芐、菲類等[16]。由于中藥材的特殊屬性要求其品質(zhì)均一、穩(wěn)定，因此不同附生樹(shù)種對(duì)鐵皮石斛化學(xué)成分的影響值得深入研究。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)因具有較高的靈敏度和分辨率，并且能夠快速解析等特點(diǎn)在成分復(fù)雜的中藥材定性、定量的分析研究中得到了廣泛的應(yīng)用。主成分分析(Principal component analysis，PCA)法是一種通過(guò)降維思想，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)相互獨(dú)立并可反映出總體信息的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，該方法可從多元復(fù)雜的事物中揭示出現(xiàn)象，有效地避免主觀因素對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響[17-18]。本研究將采用UPLC-MS 技術(shù)結(jié)合主成分分析的方法對(duì)不同附生樹(shù)種栽培鐵皮石斛進(jìn)行比較分析，以期發(fā)現(xiàn)不同附生樹(shù)種栽培對(duì)鐵皮石斛物質(zhì)基礎(chǔ)的影響，為鐵皮石斛藥材的來(lái)源鑒別及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 不同附生樹(shù)種來(lái)源的鐵皮石斛樣品采自于貴州省興義市安龍縣，均為2年生植株，經(jīng)作者鑒定為鐵皮石斛Dendrobiumofficinale。

表1 不同附生樹(shù)種鐵皮石斛樣本

編號(hào)附生樹(shù)種D1～D18青杠QuercusacutissimaD19～D36木荷SchimasuperbaD37～D54板栗Castaneamollissima

1.2 儀器與試劑 Thermo Ultrmate 3000 型號(hào)超高效液相、Thermo Scientific Q Exactive 四極桿高分辨質(zhì)譜儀、Mass Frontier 7.0 質(zhì)譜分析系統(tǒng)軟件(美國(guó)Thermo Fisher科技公司); Milli-Q 超純水儀(美國(guó)Millipore公司); XS205 型電子天平(瑞士梅特勒-托利公司); S10型高速勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。乙腈及甲酸均為質(zhì)譜純，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備 取新鮮的鐵皮石斛莖約2.0g，加入70%乙醇40 mL，稱取總重量，經(jīng)勻漿破碎后，再超聲處理40 min，以70%乙醇溶液補(bǔ)足重量，離心5 min(轉(zhuǎn)速為2 500 rpm)，用移液槍取20μL離心上清液，加入70%乙醇980 μL稀釋至50倍，再離心10 min(轉(zhuǎn)速為13 000 rpm)，取離心后的上清液經(jīng) 0.22 μm濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)溶液備用。

2.2 高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)分析 采用Hypersil Gold C18色 譜 柱(2.1 mm × 150 mm，1.9 μm)進(jìn)行超高效液相分析，柱溫40 ℃，以乙腈(A) -0.1% 甲酸水溶液(B) 為流動(dòng)相梯度洗脫，梯度程序?yàn)椋?～0.5 min，5% A; 0.5～1.5 min，5%～60% A; 1.5～7 min，60%～95% A；7～10 min，95%A；10.1～12 min，5% A，流動(dòng)相流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

采用 ESI 離子化方式質(zhì)譜系統(tǒng)，霧化溫度為300℃，傳輸管溫度為350℃，鞘氣為 30 arb，輔助氣為 15 arb，掃描模式為 Full Scan /Targeted-ddMS2 /負(fù)離子掃描，質(zhì)譜分辨率為 MS Full Scan 1 /70000，MS /MS Full Scan 1 /15000。

鐵皮石斛樣品溶液經(jīng)UPLC-ESI-Orbitrap-MS技術(shù)分析的總離子流圖如圖 1所示。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 將經(jīng)UPLC-MS分離采集到的各離子峰面積及保留時(shí)間導(dǎo)入Excel中整理，利用R語(yǔ)言中自帶的stats數(shù)據(jù)包中的princomp函數(shù)對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

A ：正離子模式；B：負(fù)離子模式。圖1 鐵皮石斛總離子流

3 結(jié)果

本研究通過(guò)UPLC-ESI-Orbitrap-MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同附生樹(shù)種來(lái)源的鐵皮石斛莖中的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分離分析，共采集得到1500多個(gè)離子峰，將單個(gè)的離子峰的峰面積設(shè)定為特征變量，應(yīng)用R語(yǔ)言對(duì)不同樹(shù)種附生的鐵皮石斛樣品進(jìn)行PCA 分析。研究結(jié)果顯示不同樹(shù)種附生的鐵皮石斛具有明顯的區(qū)分度(見(jiàn)圖2)，其最主要的差異表現(xiàn)在PC1維度。在PCA圖中可以看出附生在青杠樹(shù)上的鐵皮石斛樣本最為集中，說(shuō)明其品質(zhì)最為穩(wěn)定；附生在木荷樹(shù)上的鐵皮石斛相對(duì)集中，說(shuō)明其品質(zhì)也較為穩(wěn)定；而附生在板栗樹(shù)上的鐵皮石斛樣本在圖中呈現(xiàn)出兩個(gè)區(qū)域，說(shuō)明板栗樹(shù)附生鐵皮石斛中的次生代謝產(chǎn)物變異最大，以其作為附生樹(shù)種將會(huì)對(duì)鐵皮石斛藥材品質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大的影響。進(jìn)一步通過(guò)主成分載荷圖分析，發(fā)現(xiàn)離子峰704、897、899、911、744是引起不同樹(shù)種附生的鐵皮石斛樣品差異的主要化學(xué)物質(zhì)，下一步有必要對(duì)產(chǎn)生這些離子峰的化合物的結(jié)構(gòu)深入研究，進(jìn)一步明確不同樹(shù)種附生鐵皮石斛樣品差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。

A:得分；B:載荷。圖2 三種附生樹(shù)種來(lái)源鐵皮石斛PCA分析

4 討論

鐵皮石斛為我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥材之一，特別是近些年隨著人們生活水平的提高，保健需求不斷提升，鐵皮石斛因其傳統(tǒng)保健功效，尤其是具有“九大仙草之首”的美譽(yù)備受消費(fèi)者推崇，然而由于長(zhǎng)期的人類采挖，在自然界中野生的鐵皮石斛已處于瀕臨滅絕。隨著回歸自然的市場(chǎng)需求越來(lái)越大，鐵皮石斛的人工栽培模式也由大棚栽培向仿野生栽培發(fā)展，尤其是以林下活樹(shù)附生栽培的方式最受推崇，但不同附生樹(shù)種栽培的鐵皮石斛是否具有差異的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。僅羅在柒等[19]曾報(bào)道了不同栽培方式的鐵皮石斛多糖含量的差異，但鐵皮石斛除了含有多糖外，還含有其它多種化學(xué)成分，如黃酮、聯(lián)芐、生物堿等，全面對(duì)比不同樹(shù)種附生鐵皮石斛中的化學(xué)成分對(duì)于其品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制具有重要意義。

自新中國(guó)第一版《中國(guó)藥典》規(guī)定石斛藥材來(lái)源為蘭科石斛屬植物至2015年版《中國(guó)藥典》將鐵皮石斛單列，金釵石斛等三種石斛栽培品及其同屬植物近似種均可作為“石斛”藥材使用，并且還有文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道在各地有非石斛屬植物作為“石斛”使用的現(xiàn)象，這些都說(shuō)明“石斛”藥材來(lái)源非常復(fù)雜，為其臨床用藥的有效性及安全性帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期以來(lái)，石斛類藥材的鑒別一直是生藥學(xué)專家研究的熱點(diǎn)，分子生物學(xué)的發(fā)展為石斛類藥材的種間鑒別提供了可能，但是無(wú)法評(píng)價(jià)種內(nèi)的品質(zhì)優(yōu)劣。中藥材的品質(zhì)主要是由其所含有的化學(xué)成分所決定的，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)因具有較高的靈敏度和分辨率，并且能夠快速解析等特點(diǎn)在化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材定性、定量的分析研究中得到了廣泛的應(yīng)用。為此，本研究嘗試通過(guò)UPLC-ESI-Orbitrap-MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合PCA分析對(duì)不同樹(shù)種附生的鐵皮石斛樣品進(jìn)行對(duì)比分析，以期能夠通過(guò)不同來(lái)源鐵皮石斛中的化學(xué)成分差異來(lái)鑒別其來(lái)源。

貴州省興義市安龍縣石斛谷，位于安龍縣南盤江河谷國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園，是全國(guó)最大的鐵皮石斛附樹(shù)仿野生栽培基地，該地石斛主要附著栽培于當(dāng)?shù)靥厣珮?shù)種青杠樹(shù)、木荷樹(shù)、板栗樹(shù)樹(shù)干，具有一定代表性。經(jīng)對(duì)這些來(lái)源的鐵皮石斛中的化學(xué)成分為整體輪廓，經(jīng)過(guò)PCA分析表明：3種來(lái)源的鐵皮石斛樣品在PCA得分圖上可以得到明顯的區(qū)分；尤其是青杠樹(shù)附生的鐵皮石斛樣品化學(xué)成分較為穩(wěn)定，板栗樹(shù)附生的鐵皮石斛中化學(xué)成分變化較大。因此，采用UPLC-ESI-Orbitrap- MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合PCA分析可以用來(lái)區(qū)分不同附生樹(shù)種栽培的鐵皮石斛來(lái)源，并可為今后品質(zhì)穩(wěn)定的鐵皮石斛附樹(shù)栽培中樹(shù)種的選擇提供參考，也可為鐵皮石斛藥材的質(zhì)量追溯系統(tǒng)建立提供依據(jù)。