范同強(qiáng)　黃有軍

摘要 為了研究不同碳氮比對(duì)小球藻增殖及油脂積累的影響，采用BBM培養(yǎng)基，以蔗糖為碳源，硝酸銨為氮源，在12 h光照和12 h黑暗的條件下混合培養(yǎng)小球藻。設(shè)計(jì)不同的碳氮比例，采用OD680來(lái)評(píng)價(jià)小球藻的生長(zhǎng)情況，以鹽酸破壁后用提取液提取油脂，計(jì)算不同處理下的小球藻油脂積累情況，并利用氣相測(cè)定脂肪酸成分。結(jié)果表明：60/1比例下藻種出現(xiàn)最大的生長(zhǎng)量，其次是30/1。而30/1比例下藻種出現(xiàn)最大的油脂積累率，其次是60/1。檢測(cè)得各處理所含脂肪酸成分基本相同，均含有C14、C15、C16、C17、C18、C20;而30/9和60/1處理還含有C12成分。30/1和60/1這2個(gè)處理含主要脂肪酸為C16∶0、C18∶0和C18∶2，含量為70%～74%，其余4個(gè)處理主要脂肪酸為C16∶0和C18∶0，含量為80%～86%。

關(guān)鍵詞 小球藻;碳氮比;生長(zhǎng)量;油脂積累

中圖分類(lèi)號(hào) TE667文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）11-0007-04

Abstract To investigate the effects of different carbonnitrogen ratios on Chlorellas proliferation and lipid accumulation，BBM medium was used to culture Chlorella under 12hour of light and 12hour of darkness with sucrose as carbon source and ammonium nitrate as nitrogen source. Different ratios of carbon and nitrogen were designed，OD680was used to evaluate the growth of Chlorella，the oil was extracted after the cell wall was broken by hydrochloric acid. The oil accumulation of Chlorella was calculated under different treatments.And the composition of fatty acids was determined by gasphase. The experimental results showed that the maximum growth rate of Chlorella was 60/1， followed by 30/1. While 30/1 radio showed maximum oil accumulation rate， followed by 60/1. The fatty acid composition in each group was basically the same， including C14， C15， C16， C17， C18and C20， while the treatment of 30/9 and 60/1 also contained another C12. The main fatty acids in 30/1 and 60/1 groups were C16∶0， C18∶0and C18∶2， with the content of about 70%-74%， while the other four treatments were C16∶0and C18∶0， with the content of about 80%-86%.

Key words Chlorella;Carbonnitrogen ratio;Growth;Lipid accumulation

近年來(lái)隨著煤炭、石油等化石燃料的日益枯竭，科學(xué)家們將研究對(duì)象轉(zhuǎn)向高效、清潔、可再生的生物能源。生物柴油是一種以動(dòng)植物油脂為原料制備、可替代化石柴油的綠色新能源。然而，以動(dòng)植物油脂為原料的生物柴油其原料成本占總生產(chǎn)成本的75%左右并且消耗大;可食用的植物油脂以餐飲廢棄油脂為原料雖然可有效降低生產(chǎn)成本，但原料來(lái)源有限，難以滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，且產(chǎn)品的質(zhì)量難以保證。微藻是一類(lèi)單細(xì)胞藻類(lèi)，其在特定的條件下可大量積累油脂，而且藻油具有與一般植物油脂類(lèi)似的脂肪酸結(jié)構(gòu)，因此被認(rèn)為是一種具有巨大潛力的新型生物柴油油脂原料[1]。與油料作物相比，微藻具有細(xì)胞增殖快、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和土地的限制和所需的培養(yǎng)基來(lái)源豐富等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，通過(guò)培養(yǎng)微藻獲取藻油對(duì)于保證油脂原料的可持續(xù)供應(yīng)，促進(jìn)生物柴油的廣泛生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義[3-4]。該研究以小球藻（Chlorella sp.）為材料，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的碳氮比例對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，記錄過(guò)程中小球藻各指標(biāo)的變化情況，計(jì)算并分析相關(guān)數(shù)據(jù)得出有關(guān)規(guī)律，最終選出最適于小球藻增殖和油脂積累的碳氮比。

1 材料與方法

1.1 藻種

小球藻（Chlorella sorokiniana）從中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物所購(gòu)得。

1.2 儀器和設(shè)備

AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;SpH-3332型基本型大容量雙層搖瓶機(jī)（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;TDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）;CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)（Hitachi Koki Co.，Ltd.）;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）;GC-2010型氣相色譜儀（日本島津公司）。

1.3 不同培養(yǎng)基的配置

小球藻采用BBM培養(yǎng)基（4.5 L）為基本培養(yǎng)液（表1）。另在BBM培養(yǎng)液中加入蔗糖和硝酸銨的量分別為10.26、0.08，10.26、0.24，10.26、0.72，20.52、0.08，20.52、0.24，20.52、0.72 g/L，使6種培養(yǎng)基中的C/N比為30/1、30/3、30/9、60/1、60/3、60/9。

1.4 藻種培養(yǎng)

試驗(yàn)在裝液量為300 mL的500 mL圓底燒瓶中進(jìn)行。接種量為5 mL[3]，培養(yǎng)溫度為室溫，初始pH為7.0，光照時(shí)間為12 h黑暗交替，光照強(qiáng)度為2 000 lx，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。自接種日到試驗(yàn)結(jié)束共培養(yǎng)18 d。

1.5 樣品測(cè)定

1.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定。采用7230G型紫外分光光度計(jì)測(cè)定藻液在680 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，用OD680變化表征小球藻的生長(zhǎng)情況[5]，每個(gè)比例選擇一個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。從接種日起，隔2 d測(cè)1次，培養(yǎng)18 d后結(jié)束。

1.5.2 藻粉的收集。收集不同培養(yǎng)階段的小球藻藻液，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，蒸餾水沖洗藻泥，收集藻液，在80 ℃的溫度下烘干至恒重。

1.5.3 油脂的收集及含量測(cè)定。①將收集的干燥小球藻藻粉研磨均勻。②每個(gè)比例都稱(chēng)取0.04 g左右（重量計(jì)為m）藻粉放入10 mL的離心管中。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。③向裝有藻粉的離心管中加入0.5 mL的濃鹽酸，蓋上蓋子在80 ℃水浴10 min，開(kāi)蓋繼續(xù)水浴5 min。④經(jīng)鹽酸處理后，再向離心管內(nèi)加入1∶1的乙酸乙酯和正己烷的提取液進(jìn)行提取。加入提取液的離心管在水浴中多次搖晃混勻，提取10 min，共提取3次，每次提取液的量分別為5、4、4 mL。⑤在11 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，提取后的溶液合并入20 mL的離心管中，加入6 mL蒸餾水，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min。⑥準(zhǔn)備足量干燥的培養(yǎng)皿并稱(chēng)重記為W1，將離心后的上層液取出混合放入已準(zhǔn)備的干凈培養(yǎng)皿內(nèi)，恒溫水浴揮干提取劑。⑦培養(yǎng)皿烘干后，再稱(chēng)取培養(yǎng)皿重量記為W2，故油脂含量C=（W2 - W1）/m×100%。

1.5.4 油脂成分的測(cè)定。用氣相色譜測(cè)定脂肪酸成分，以氫火焰檢測(cè)器檢測(cè)。其工作條件為載氣（N2）流速為3 mL/min;升溫程序：100 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速度升溫至180 ℃，再以3 ℃/min的速度升至240 ℃，保持9 min;氫火焰檢測(cè)器中H2的流速為47 mL/min，空氣流速為400 mL/min，溫度為250 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)分析用Excel 2003分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并作圖。用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較（Duncans檢驗(yàn)，α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮比對(duì)小球藻增殖的影響

小球藻從接種到收獲共培養(yǎng)18 d。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，培養(yǎng)液顏色逐漸由無(wú)色變成綠色再變成棕黃色最后變成黃白色。但培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化的起始時(shí)間及變化程度因碳氮比例不同而不同。具體地，60/9處理最先發(fā)生顏色變化;隨后，30/9、60/3、30/3等處理依次發(fā)生變化;而30/1、60/1處理在培養(yǎng)過(guò)程中顏色變化不明顯（圖1）。Prabakaran等[6]研究表明，氮源供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致藻胞內(nèi)葉綠素和胡蘿卜素合成受到限制，使得藻胞呈色變化不明顯。這合理地解釋了我們所觀察到的現(xiàn)象。

小球藻培養(yǎng)18 d內(nèi)每個(gè)樣品各測(cè)取OD6806次，數(shù)據(jù)顯示每個(gè)處理的變化趨勢(shì)是隨著時(shí)間推移而波動(dòng)的。由圖2可知，當(dāng)小球藻生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，碳氮比為60/1的小球藻OD680最大，達(dá)0.916;其次是30/1的處理，為0.767;60/3、30/3和30/9這3個(gè)處理的最終值相近，為0.650～0.690;而60/9處理的OD680最小，為0.544。其中，60/1、30/1這2個(gè)處理的數(shù)值變化逐漸上升;60/3、30/3和30/9這3個(gè)處理的變化是先上升后下降;而60/9處理的變化不明顯。數(shù)據(jù)表明碳氮比值較大可促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)，碳氮比值大即碳源量相對(duì)較大，這與劉香華等[7]研究表明的碳源有利于小球藻的增殖理論相一致。同時(shí)可初步確定小球藻生長(zhǎng)所需的碳氮最適配比為60/1，其次是30/1。

2.2 不同碳氮比對(duì)小球藻油脂積累的影響

2.2.1 油脂積累情況。取不同培養(yǎng)時(shí)間的小球藻藻液測(cè)定其油脂百分含量，共計(jì)3次。分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期，小球藻的油脂積累率最高為處理30/1，最高值為27.86%;培養(yǎng)中期，小球藻的油脂積累率最大值為30.70%，該值在處理30/1中測(cè)得;培養(yǎng)末期，小球藻的油脂積累率由高到低的處理順序是30/1、60/1、30/3、60/9、30/9、60/3，最高達(dá)34.32%（圖3）。其中，30/1處理在培養(yǎng)末期達(dá)到最大的油脂積累率，為3432%;其次是處理60/1，達(dá)30.09%，而30/3、60/3、30/9、60/9四者的油脂積累率相近，為17.6%～25.70%。

2.2.2 油脂積累率方差分析。第6天，處理30/1和其他5組處理間存在極顯著性差異（表2）;處理30/3分別和30/9、60/9存在極顯著性差異;處理60/1、60/3與30/9、60/9也存在極顯著差異。第12天，處理30/1和處理30/9、60/3、60/9存在極顯著差異;處理60/1、30/3和處理30/9、60/3、60/9也都存在極顯著差異。第18天，處理30/1和其余各處理都存在極顯著差異。綜上可初步確定小球藻油脂積累的最佳碳氮配比是30/1，其次是60/1。

2.3 不同碳氮比對(duì)小球藻脂肪酸組成的影響

研究表明[8]在同濃度的相同碳源中，處于穩(wěn)定期的小球藻更趨向于油脂的積累，該試驗(yàn)所研究的即是穩(wěn)定期不同碳氮比培養(yǎng)基中小球藻脂肪酸組成成分（表3）。6個(gè)不同碳氮比處理的小球藻油脂中都包含了C14、C15、C16、C17、C18、C206種脂肪酸成分;而處理30/9和60/1的小球藻油脂中除上述6種脂肪酸外還具有C12脂肪酸。其中30/1和60/1兩者的小球藻油脂中主要脂肪酸為C16∶0、C18∶0和C18∶2，占總脂肪酸含量的70%～74%，其余四者的小球藻油脂中主要脂肪酸為C16∶0和C18∶0，占總脂肪酸含量的80%～86%;各個(gè)處理油脂成分都由飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸三者組成，其中飽和脂肪酸總量遠(yuǎn)大于不飽和脂肪酸總量。具體地，30/1和60/1組合多不飽和脂肪酸大于單不飽和脂肪酸的現(xiàn)象較為明顯，而其余組合這2種不飽和脂肪酸的含量相差不明顯[9]。

3 結(jié)論與討論

氮源供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致藻胞內(nèi)葉綠素和胡蘿卜素合成受到限制，使得藻胞呈色變化不明顯。較大的碳氮比可促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，即高碳低氮的處理環(huán)境有利于小球藻增殖。該試驗(yàn)初步確定小球藻生長(zhǎng)所需的碳氮最適配比為60/1，其次是30/1。在氮濃度較低的情況下，碳氮比較小者可促進(jìn)油脂的積累。該試驗(yàn)初步確定有利于小球藻油脂積累的最適碳氮配比是30/1，其次是60/1。各處理所含脂肪酸成分基本相同，分別為C14、C15、C16、C17、C18、C206種，而30/9和60/1處理除以上成分之外，還含有C12脂肪酸。30/1和60/1這2個(gè)處理主要脂肪酸為C16∶0、C18∶0和C18∶2，含量為70%～74%，其余四者主要脂肪酸為C16∶0和C18∶0，含量為80%～86%。各個(gè)處理油脂成分都由飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸三者組成，其中飽和脂肪酸總量遠(yuǎn)大于不飽和脂肪酸總量。

近年內(nèi)，科學(xué)者對(duì)小球藻增殖和油脂積累情況的研究有了不少的成果。眾多研究表明培養(yǎng)基中氮水平是影響微藻生化成分的最主要因素。故大多數(shù)關(guān)于氮源的研究都是在低氮濃度，即氮限制的條件下進(jìn)行的。也有少量文獻(xiàn)報(bào)道了非限制性或高氮濃度下的微藻培養(yǎng)，這通?？傻玫娇偵锪炕蚰撤N成分的最大生成量，但總脂占干重的百分?jǐn)?shù)有所下降。眾多研究證實(shí)隨著氮濃度的減少，小球藻生長(zhǎng)量也隨之減少但其油脂積累增加，因?yàn)樵诘蛔銜r(shí)碳元素更多地趨向于合成脂質(zhì)和碳水化合物，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，相對(duì)高濃度的氮源有利于生物量的增加但不利于油脂的積累[5，7]，該試驗(yàn)現(xiàn)象與之相符。

在不同的碳氮比下研究細(xì)胞內(nèi)油脂的含量和脂肪酸的組成，發(fā)現(xiàn)碳限制或氮限制均能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成。但前者更為明顯，因?yàn)檩^低的碳氮比使不飽和脂肪酸增加更為明顯。當(dāng)碳氮比較高時(shí)，碳供應(yīng)過(guò)量，氮成為限制性因素，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的增加可用碳儲(chǔ)存機(jī)制解釋。氮限制性培養(yǎng)常會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的飽和程度，這可能是因?yàn)榈呛铣砂被崴匦璧脑?，氮限制性培養(yǎng)會(huì)使氨基酸的合成減少，從而引起蛋白質(zhì)含量豐富的色素體的生成減少，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)磷脂以及與這些細(xì)胞器相關(guān)的甘油脂（均為膜結(jié)構(gòu)組分）的需求降低。細(xì)胞內(nèi)主要的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸絕大部分位于細(xì)胞膜的極性脂中，所以當(dāng)膜結(jié)構(gòu)減少時(shí)，PUFA含量相應(yīng)下降[10]。這可以用來(lái)解釋該試驗(yàn)中圖3的部分結(jié)果。因?yàn)橹?lèi)中脂肪酸分布不同，所以由培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)期的變化引起的脂類(lèi)組成的變化將導(dǎo)致胞內(nèi)總的脂肪酸組成的變化。

該試驗(yàn)研究了小球藻培養(yǎng)液中不同碳氮比對(duì)小球藻增殖、油脂積累和脂肪酸成分的影響，所得結(jié)果可從碳氮比整體、碳氮各自濃度高低、生長(zhǎng)期等各方面進(jìn)行分析，它是一個(gè)交互影響的結(jié)果。

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