曹丹 白騰飛 劉偉 汪飛 趙瑞華 高瑜 賀曉龍

摘 要 為探究鎂離子、鈣離子、鋅離子、錳離子對北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響，為北蟲草工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)，采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，以北蟲草菌絲生物量為指標(biāo)，綜合其長勢和培養(yǎng)基狀態(tài)，選擇出最優(yōu)二價(jià)鹽離子組合。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鎂離子為0.10 mg·mL-1，鈣離子為0.02 mg·mL-1，鋅離子為0.02 mg·mL-1，錳離子為0.02 mg·mL-1時北蟲草的生物量達(dá)到最大，得到最優(yōu)的二價(jià)鹽離子組合。

關(guān)鍵詞 北蟲草;液體發(fā)酵;無機(jī)鹽;二價(jià)鹽離子

中圖分類號：S567.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.070

北蟲草又名北冬蟲夏草、蛹草等，屬真菌門，子囊菌亞門，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬，是一大類重要的昆蟲病原真菌[1]。蛹蟲草是蟲草屬的模式種。研究證明，北蟲草與冬蟲夏草在藥化和藥理上十分相似，在功能食品、醫(yī)藥和生物學(xué)技術(shù)方面有很好的食用價(jià)值[2]。近幾年，由于市場需求日益擴(kuò)大，野生的冬蟲夏草已經(jīng)不能滿足現(xiàn)在的市場需要，所以與冬蟲夏草具有相同作用的北蟲草菌絲體被生產(chǎn)成各種保健營養(yǎng)品，但由于傳統(tǒng)的固體栽培時間長，菌齡不統(tǒng)一等因素，不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)的要求，所以液體發(fā)酵培養(yǎng)將成為北蟲草人工栽培的重要方式。液體發(fā)酵栽培生長周期短，出菇整齊，有利于接種，有利于工廠化、規(guī)?；痆3]。本次試驗(yàn)探究北蟲草液體發(fā)酵過程中的二價(jià)礦物鹽離子對菌種菌絲的影響，通過試驗(yàn)比較出適合北蟲草生長的二價(jià)鹽離子，為人工液體栽培北蟲草提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

北蟲草CY-1，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試藥品

葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、維生素B1、維生素B6、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鈣等。

1.1.3 儀器設(shè)備

高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、UV-2600紫外可見分光光度計(jì)等試驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH自然。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、維生素B1 20 μg·L-1、維生素B6 10 μg·L-1、pH自然。

1.2.2 供試菌種的活化

取出保存在實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱中的北蟲草菌種，放在室溫條件下，經(jīng)過12 h的室溫處理，使菌種活化，供試驗(yàn)使用。

1.2.3 供試菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

取1.8 cm×20.0 cm的試管，裝入10 mL配制好的PDA培養(yǎng)基，將試管放在高壓滅菌鍋中進(jìn)行121 ℃、30 min的滅菌，滅菌完成后冷卻制成斜面培養(yǎng)基。利用超凈工作臺，在嚴(yán)格控制的無菌條件下，鏟取0.5 cm2菌塊到新制作的PDA培養(yǎng)基上。將接種的PDA斜面試管放置在溫度控制為21 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)8～10 d，備用。

1.2.4 菌絲體液體培養(yǎng)

取150 mL的三角搖瓶，加入50 mL已經(jīng)配制好的培養(yǎng)液，將配制好的培養(yǎng)液在高壓滅菌鍋中進(jìn)行121 ℃、30 min滅菌，滅菌完成后制成液體培養(yǎng)基，靜置1 d，檢查滅菌情況。利用超凈工作臺，在無菌條件下向培養(yǎng)液中接入新培養(yǎng)的斜面菌種，接種量為0.5 cm2一塊。將接好種的液體培養(yǎng)基在23 ℃靜置24 h，然后置于23 ℃，180 r·min-1的恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)12 d。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 鎂離子對北蟲草液體發(fā)酵的影響試驗(yàn)

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1的鎂離子替代原有液體培養(yǎng)基中的二價(jià)金屬鹽離子，設(shè)計(jì)5組重復(fù)試驗(yàn)。在培養(yǎng)的過程中測定液體培養(yǎng)基第8天的菌絲生物量，得出相關(guān)的具體數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，同時觀察菌絲的萌發(fā)時間、菌絲球的生長情況、發(fā)酵液狀態(tài)等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.2 鈣離子對北蟲草液體發(fā)酵的影響試驗(yàn)

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的鈣離子替代原有液體培養(yǎng)基中的二價(jià)金屬鹽離子，設(shè)計(jì)5組重復(fù)。在培養(yǎng)的過程中測定液體培養(yǎng)基第8天的菌絲生物量，得出相關(guān)的具體數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，同時觀察菌絲的萌發(fā)時間、菌絲球的生長情況、發(fā)酵液狀態(tài)等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.3 鋅離子對北蟲草液體發(fā)酵的影響試驗(yàn)

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的鋅離子替代原有液體培養(yǎng)基中的二價(jià)金屬鹽離子，設(shè)計(jì)5組重復(fù)。在培養(yǎng)的過程中測定液體培養(yǎng)基第8天的菌絲生物量，得出相關(guān)的具體數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，同時觀察菌絲的萌發(fā)時間、菌絲球的生長情況、發(fā)酵液狀態(tài)等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.4 錳離子對北蟲草液體發(fā)酵的影響試驗(yàn)

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1的錳離子替代原有液體培養(yǎng)基中的二價(jià)金屬鹽離子，設(shè)計(jì)5組重復(fù)。在培養(yǎng)的過程中測定培養(yǎng)基第8天的菌絲生物量，得出相關(guān)的具體數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，同時觀察菌絲的萌發(fā)時間、菌絲球的生長情況、發(fā)酵液狀態(tài)等并做好記錄，制作分析圖表。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，用4種不同二價(jià)金屬陽離子的合適離子濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)為4因素3水平表試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鎂離子對北蟲草液體培養(yǎng)的影響

根據(jù)試驗(yàn)得到鎂離子濃度在0.00 mg·mL-1、

0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數(shù)據(jù)分析、整理得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)可以看出鎂離子濃度對北蟲草液體發(fā)酵生物量的影響：在離子濃度為0.10 mg·mL-1時，北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的生物量最大;離子濃度在

0.00 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1時菌絲的萌發(fā)時間較短;離子濃度在0.10 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好，發(fā)酵液的相對性狀也最好。綜合以上數(shù)據(jù)分析可以得出，當(dāng)鎂離子濃度為0.10 mg·mL-1時單因素試驗(yàn)的結(jié)果最好，所以選擇鎂離子濃度為0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1做正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究二價(jià)鹽離子對北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響。

2.1.2 鈣離子對北蟲草液體培養(yǎng)的影響

根據(jù)試驗(yàn)得到鈣離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數(shù)據(jù)分析、整理得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)可以得出鈣離子濃度對北蟲草液體發(fā)酵生物量的影響。在離子濃度為0.05 mg·mL-1時北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的生物量最大;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌絲的萌發(fā)時間較短;離子濃度在0.05 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時發(fā)酵液的相對性狀最好。綜合以上數(shù)據(jù)分析可以得出，當(dāng)鈣離子濃度為0.05 mg·mL-1時單因素試驗(yàn)的結(jié)果最好，所以選擇鈣離子濃度為0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究二價(jià)鹽離子對北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響。

2.1.3 鋅離子對北蟲草液體培養(yǎng)的影響

根據(jù)試驗(yàn)得到鋅離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數(shù)據(jù)分析、整理得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)可以看出鋅離子濃度對北蟲草液體發(fā)酵生物量的影響。在離子濃度為0.05 mg·mL-1時北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的生物量最大;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌絲的萌發(fā)時間較短;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時發(fā)酵液的相對性狀最好。綜合以上的數(shù)據(jù)分析可以得出，當(dāng)鋅離子濃度為0.05 mg·mL-1時單因素試驗(yàn)的結(jié)果最好，所以選擇鋅離子濃度為0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究二價(jià)鹽離子對北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響。

2.1.4 錳離子對北蟲草液體培養(yǎng)的影響

根據(jù)試驗(yàn)得到錳離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數(shù)據(jù)分析、整理得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表5。

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)可以看出錳離子濃度對北蟲草液體發(fā)酵生物量的影響。在離子濃度為0.02 mg·mL-1時北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的生物量最大，菌絲的萌發(fā)時間較短，菌球的生長狀況最好，發(fā)酵液的相對性狀最好。綜合以上的數(shù)據(jù)分析可以得出，當(dāng)錳離子濃度為0.02 mg·mL-1時單因素試驗(yàn)的結(jié)果最好，所以選擇錳離子濃度為0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1做正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究二價(jià)鹽離子對北蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)通過數(shù)據(jù)分析、整理得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表6。

由表6可以看出，試驗(yàn)6的菌絲生物量最高，達(dá)到0.432 9 g;其次是試驗(yàn)4，可達(dá)到0.411 5 g;試驗(yàn)7和試驗(yàn)9的菌絲生物量最低。通過極差分析的數(shù)據(jù)對比可以看出，4種二價(jià)鹽離子對北蟲草液體菌種菌絲生物量的影響順序?yàn)锳>C>B>D，其中A是影響北蟲草液體菌種菌絲生物量的最主要因子，其次為C和B，對北蟲草液體菌種菌絲生物量的影響最小的是D，再綜合菌球生長狀況和發(fā)酵液性狀可以得出其最佳的培養(yǎng)組合為A2B1C1D2。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)分別通過比較各二價(jià)鹽離子對北蟲草菌絲生物量、發(fā)酵過程中的相關(guān)生理特征的影響，運(yùn)用科學(xué)的統(tǒng)計(jì)方法和數(shù)據(jù)分析手段進(jìn)行試驗(yàn)以及結(jié)果分析，最終得出上述圖表。通過對4種二價(jià)鹽離子的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，二價(jià)鹽離子在較低濃度時對北蟲草的生長和發(fā)育起到了明顯的促進(jìn)作用，在離子濃度進(jìn)一步升高時，逐漸顯現(xiàn)出了相應(yīng)的抑制和毒害作用。根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，做正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的結(jié)果表明當(dāng)鎂離子為0.10 mg·mL-1、鈣離子為0.08 mg·mL-1、鋅離子為0.02 mg·mL-1、錳離子為0.02 mg·mL-1時北蟲草的菌絲干重達(dá)到最高，得到最佳二價(jià)鹽離子組合為A2B1C1D2。

本試驗(yàn)因?yàn)閷?shí)際試驗(yàn)室儀器和試驗(yàn)環(huán)境的限制，無法對優(yōu)化的北蟲草液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中的各種理化性質(zhì)進(jìn)行分子水平鑒定，為了促使這四種二價(jià)鹽離子更好更穩(wěn)定地應(yīng)用于生產(chǎn)，還需做后續(xù)的配套出菇試驗(yàn)，進(jìn)行進(jìn)一步的探索和研究。

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（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-02-21

基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目“北蟲草種質(zhì)資源引進(jìn)與栽培技術(shù)研究”（2020NY-078）;延安市重大科技成果轉(zhuǎn)化資金專項(xiàng)項(xiàng)目“延安地區(qū)北蟲草栽培技術(shù)示范與推廣應(yīng)用推廣”（2017CGZH-03）;延安市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目“延安北蟲草種質(zhì)資源引進(jìn)與栽培技術(shù)研究”;延安大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目“延安地區(qū)北蟲草人工栽培及初加工研發(fā)與利用”（CYFP201902）;陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“幾種二價(jià)離子對北蟲草人工栽培的影響”（S201910719008）。

作者簡介：曹丹（1996—），女，陜西長武人，本科在讀，研究方向?yàn)槭秤镁耘唷?/p>

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