孫成韜 劉曉麗 王延波

關(guān)鍵詞：玉米;噴淋法;加倍率;單倍體;秋水仙素

玉米常規(guī)方法育種選育自交系，周期比較長(zhǎng)、速度比較慢，限制了玉米品種研發(fā)和更新速度。以玉米孤雌誘導(dǎo)系為基礎(chǔ)的雙單倍體（DH）育種技術(shù)可以有效地縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，為種質(zhì)的改良和新品種的選育提供重要的技術(shù)支撐[1-2]。DH育種技術(shù)已經(jīng)在國(guó)際多家單位中得到大規(guī)模的應(yīng)用[3]，我國(guó)很多單位也相繼開(kāi)展了單倍體育種技術(shù)研究和應(yīng)用。

玉米單倍體育種技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)際研究熱點(diǎn)之一，隨著誘導(dǎo)基因的精細(xì)定位和機(jī)制的揭示，產(chǎn)生單倍體的理論基礎(chǔ)得以進(jìn)一步明確，它已是培育玉米新材料和新品種的最高效的技術(shù)手段[3]。然而，單倍體自然加倍成二倍體比較困難，即加倍率低，目前加倍率達(dá)10%是很難實(shí)現(xiàn)的[4-6]。Wan等研究報(bào)道，許多玉米種質(zhì)單倍體植株自然加倍率低于5%，有些種質(zhì)甚至根本不發(fā)生自然加倍[7-8]。我國(guó)早期單倍體加倍以自然加倍為主，由于自然加倍率低不能滿足生產(chǎn)的需要，現(xiàn)階段主要以化學(xué)加倍為主。要獲得大量玉米DH系，才能達(dá)到選優(yōu)的目的，必須借助單倍體人工染色體加倍技術(shù)體系。秋水仙素是目前應(yīng)用較廣泛的染色體加倍藥劑之一，能有效地抑制細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘絲的形成，促使細(xì)胞染色體數(shù)目加倍，在玉米單倍體加倍中得到廣泛應(yīng)用。關(guān)于玉米單倍體化學(xué)加倍技術(shù)和方法的報(bào)道較多[9-12]，人們對(duì)秋水仙素施用的濃度和方法進(jìn)行了探索，主要有浸泡法、注射法或滴心法、噴淋法等。姜龍等研究的秋水仙素加倍甜玉米單倍體試驗(yàn)表明，對(duì)玉米單倍體植株傷害較嚴(yán)重，有浸芽法和針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法，存活率不超過(guò)50%[13]。浸泡法由于泡在藥液中，時(shí)間短效果不明顯，時(shí)間長(zhǎng)容易進(jìn)行無(wú)氧呼吸降低成活率;注射法或滴心法需要大量的人工，人員長(zhǎng)時(shí)間接觸秋水仙素不安全;而噴淋法操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，便于大規(guī)模應(yīng)用，減少人員與秋水仙素的接觸時(shí)間。秋水仙素噴淋法的加倍效果如何，是否達(dá)到預(yù)期的目的需要進(jìn)行驗(yàn)證。

在借鑒和學(xué)習(xí)前人研究基礎(chǔ)上利用自制噴淋加倍設(shè)備，對(duì)秋水仙素噴淋單倍體幼苗的最佳加倍濃度和時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了研究，并在最適條件下研究了不同種質(zhì)材料的噴淋加倍應(yīng)用效果，為秋水仙素噴淋法加倍單倍體籽粒的應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組1：選用迪卡516（XL21×H2671）為母本，父本誘導(dǎo)系為遼誘1號(hào)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體籽粒為試驗(yàn)材料，研究秋水仙素噴淋處理玉米單倍體幼苗的最適濃度和時(shí)長(zhǎng)。

組2：選用表1中不同種質(zhì)材料為母本，父本誘導(dǎo)系為遼誘1×CAUHOI3的雜交種，誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體籽粒為試驗(yàn)材料，研究秋水仙素噴淋對(duì)不同種質(zhì)的加倍效果。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用噴淋法：挑選后的單倍體籽粒先采用沙培法催芽，當(dāng)幼苗芽長(zhǎng)約2 cm時(shí)用剪刀將幼芽頂端胚芽鞘切掉（距離中胚軸5～10 mm），將幼苗裝入漏水的塑料筐內(nèi)，放入噴淋秋水仙素的加倍設(shè)備中，如圖1所示，為了避免噴淋裝置上下層不均勻的問(wèn)題，將該試驗(yàn)的材料全部放在最上面的一層，加倍環(huán)境均勻一致。噴淋秋水仙素，然后換成清水進(jìn)行噴淋洗苗。將其移栽至大田，用完全隨機(jī)兩因素3次重復(fù)設(shè)計(jì)。采用噴灌的方式移植大田，計(jì)算植株成活率;開(kāi)花期套袋自交，收獲后計(jì)算加倍率。

植株成活率=成活單倍體株數(shù)/出苗的種子 數(shù)×100%;加倍率=自交結(jié)實(shí)的單倍體植株數(shù)/總單倍體植株數(shù)×100%。

試驗(yàn)分2組進(jìn)行。

組1試驗(yàn)：2018年4月底在沈陽(yáng)加倍處理，設(shè)置秋水仙素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，設(shè)置噴淋時(shí)長(zhǎng)分別為6、8、10、12、14 h。

組2試驗(yàn)：2018年5月在沈陽(yáng)，以11個(gè)不同種質(zhì)材料為母本、孤雌生殖誘導(dǎo)系遼誘1×CAUHOI3的雜交種為父本誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體籽粒為試驗(yàn)材料，2018年11月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南佛羅玉米育種基地（108°46′E、18°36′N(xiāo)）進(jìn)行，秋水仙素濃度為0.625 mg/mL，噴淋時(shí)長(zhǎng)為10 h，將11個(gè)基礎(chǔ)材料的單倍體籽粒分成2份，每份中設(shè)3次重復(fù)：一份進(jìn)行直接播種，出苗后用剪刀減掉芽尖，噴淋適量清水;另一份出苗后剪掉芽尖后進(jìn)行秋水仙素噴淋加倍處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Excel 2007軟件中整理，方差分析用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件的雙因素、單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素噴淋法有利于提高幼苗的成活率

由表2可知，2018年秋水仙素噴淋濃度為 0.4 mg/mL、噴淋6 h的植株成活率最高，達(dá) 91.3%;秋水仙素濃度為0.6 mg/mL、噴淋6 h的植株成活率居第2位，為88.6%;秋水仙素噴淋濃度為1.2 mg/mL、噴淋14 h的植株成活率最低，為 62.7%。噴淋時(shí)長(zhǎng)為6 h的幼苗成活率均值為 83.7%，噴淋時(shí)長(zhǎng)為14 h的幼苗成活率均值為 68.5%;秋水仙素噴淋濃度為0.4 mg/mL的幼苗成活率均值為83.5%，秋水仙素噴淋濃度為 1.2 mg/mL 的幼苗成活率均值為68.8%。噴淋法有充足的氧氣供應(yīng)，成活率下降較慢。

由表3可知，2018年單倍體幼苗平均加倍率與噴淋濃度的關(guān)系為：0.6 mg/mL>0.8 mg/mL>1.0 mg/mL>0.4 mg/mL>1.2 mg/mL;單倍體幼苗平均加倍率與噴淋時(shí)長(zhǎng)的關(guān)系為：10 h>8 h>12 h>14 h>6 h。秋水仙素噴淋濃度為 0.6 mg/mL、噴淋10 h處理的單倍體幼苗加倍率為17.5%;秋水仙素濃度為0.6 mg/mL、噴淋8 h處理的單倍體幼苗加倍率為16.2%。試驗(yàn)表明，秋水仙素噴淋濃度為0.6 mg/mL、噴淋時(shí)長(zhǎng)為8～10 h的加倍效果較好。

由表4可知，噴淋秋水仙素的濃度和時(shí)長(zhǎng)對(duì)加倍率的影響都達(dá)到了極顯著水平。濃度的方差為167.60，時(shí)長(zhǎng)的方差為30.97，說(shuō)明噴淋秋水仙素中時(shí)長(zhǎng)效應(yīng)小于濃度效應(yīng)。

2.2 秋水仙素噴淋法的加倍效果比較明顯

由表5可知，2018年冬在海南的自然加倍率為0.55%～7.69%，秋水仙素噴淋的加倍率為 1.68%～21.33%，平均自然加倍率為2.46%，噴淋秋水仙素處理的平均加倍率為9.29%。P9的自然加倍率為7.69%，噴淋秋水仙素處理的加倍率最高，為21.33%，為對(duì)照的2.77倍;排在第2位的是P11，自然加倍率為3.03%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為17.05%，為對(duì)照的5.63倍;最低的是P1，自然加倍率僅為0.55%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為1.68%，為對(duì)照的3.05倍;第2低的是P2，自然加倍率為0.71%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為 4.48%，為對(duì)照的6.31倍。在1%水平上，P9（SS-NSS種質(zhì)）的差異只與P1（SS種質(zhì)）的差異達(dá)到極顯著水平;在5%水平上，P9（SS-NSS種質(zhì)）、P11（NSS種質(zhì)）與P1（SS種質(zhì)）差異顯著，說(shuō)明秋水仙素噴淋加倍的效果明顯，但不同遺傳背景之間的自然加倍率差異較大，噴淋秋水仙素對(duì)所有試驗(yàn)材料的加倍率都有提高作用。

2.3 秋水仙素噴淋法對(duì)不同種質(zhì)的加倍效果不同

由表6可知，秋水仙素噴淋法加倍效果與直接播種自然加倍相比達(dá)到了極顯著水平，不同種質(zhì)的遺傳特性在10%的水平上差異顯著，噴淋秋水仙素效應(yīng)大于遺傳效應(yīng)，自然加倍高的材料，秋水仙素處理后加倍率相對(duì)較高，存在一定的正相關(guān)。自然加倍率由高到低為SS-NSS種質(zhì)、NSS種質(zhì)、SS種質(zhì)。

如圖2所示，秋水仙素噴淋法對(duì)單倍體籽粒加倍效果有明顯提高，是對(duì)照的1.54～9.44倍，為對(duì)照平均值的4.93倍。自然加倍率的平均值：SS-NSS種質(zhì)（4.49）﹥NSS種質(zhì)（2.38）﹥SS種質(zhì)（148），噴淋秋水仙素加倍率的均值：NSS種質(zhì)（16.67）﹥SS-NSS種質(zhì)（10.98）﹥SS種質(zhì)（598），噴淋秋水仙素加倍率的提高的倍數(shù)：NSS種質(zhì)（6.00）﹥SS種質(zhì)（3.04）﹥SS-NSS種質(zhì)（145）。秋水仙素噴淋法對(duì)全部試驗(yàn)材料都有提高作用，是一種有效的加倍方法，利用該噴淋設(shè)備加倍單倍體籽粒的方法簡(jiǎn)便易行，安全性好。

3 討論與結(jié)論

3.1 單倍體籽粒自然加倍率低

單倍體自然加倍率已經(jīng)在業(yè)內(nèi)形成共識(shí)。王賀等研究單倍體自然加倍的情況發(fā)現(xiàn)，自然加倍率低于2.0%[14]。張坤明等研究表明，單倍體自然加倍率較低，僅為2.5%[15]。蔡泉等研究不同種質(zhì)和不同地點(diǎn)對(duì)自然加倍率的影響，獲得的自然加倍率范圍為3.88%～9.94%[16]。王文潔等研究玉米單倍體籽粒在自然加倍條件下，顯花藥率可達(dá)12.7%～57.2%，但是單倍體結(jié)實(shí)率只有1.0%～7.2%，而且有些單倍體經(jīng)過(guò)多次授粉后仍不能自交結(jié)實(shí)[17]。本研究中，2018年冬季海南不同種質(zhì)的自然加倍結(jié)實(shí)率也比較低，僅為0.55%～7.69%，因此， 單倍體的自然加倍直接應(yīng)用比較困難，急需研究有效的人工加倍技術(shù)。

3.2 處理加倍的成活率

試驗(yàn)處理后的成活率是加倍率的基礎(chǔ)。文科研究浸種法、注射法浸根法和浸芽法的加倍效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸根法和浸芽法的植株受害情況比較嚴(yán)重[18]。姜龍等研究爆裂玉米單倍體加倍方法中，成活率分別為浸根法的25.6%～39.3%、浸芽法的48.4%～78.6%、滴心葉法的26.6%～54.8%、針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法的38.2%～59.6%，總體來(lái)看這些方法成活率較低[19]。劉曉鑫等研究不同種質(zhì)用秋水仙素加倍中，成活率從89.3%下降到46.9%，下降比較明顯[20]。本研究采用秋水仙素噴淋法，保持了幼苗水分和氧氣的充足供應(yīng)，不會(huì)出現(xiàn)厭氧的情況，成活率在62.7%～91.3%，成活率較其他方法明顯提高。

3.3 秋水仙素噴淋法效果

秋水仙素噴淋加倍率受到遺傳基礎(chǔ)的影響，存在一定的正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，不同種質(zhì)的玉米單倍體幼苗噴淋秋水仙素加倍效果明顯高于自然加倍率。試驗(yàn)中噴淋秋水仙素加倍不同種質(zhì)的加倍率為1.68%～21.33%，加倍率為對(duì)照的 1.54～9.47倍，秋水仙素噴淋法的加倍效果明顯、普遍適用。而且該方法操作簡(jiǎn)便，減少人員對(duì)秋水仙素的接觸，廢液便于回收，有利于保護(hù)環(huán)境，有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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