趙位 喻東 程建國

關(guān)鍵詞：林麝;肺炎克雷伯氏菌;kp05372基因;原核表達

林麝（Moschus berezoviskii）為《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ和國家一級保護動物，其雄性分泌的麝香為名貴的中藥材和高級動物香料，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值。人工養(yǎng)殖是林麝資源保護的主要對策之一，我國從1958年開始人工養(yǎng)殖林麝，歷經(jīng)半個多世紀，發(fā)展仍較緩慢。影響林麝人工養(yǎng)殖的一個重要原因是林麝化膿性肺炎疾病的發(fā)病率和死亡率高[1]。林麝患化膿性肺炎后前期一般不易發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于較嚴重階段，基本上無救治希望[2]。引起圈養(yǎng)林麝化膿性肺炎的病原菌種類繁多，包括大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌、巴氏桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌等多種病原[3-4]。

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）屬于腸桿菌科克雷伯菌屬。自Friediander（1882年）首次從病人的肺組織中分離得到該菌后，在大熊貓、疣猴、金絲猴和林麝等多種珍稀動物體內(nèi)均分離得到該菌[5-8]。該菌為條件性致病菌，在機體免疫力下降或長期使用抗生素導致菌群失調(diào)時，可引起人或動物感染肺炎、腦膜炎、肝膿腫、腸炎、腹膜炎等多種疾病[9]。在肺炎克雷伯氏菌基因組中分布著大量轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子是最大的調(diào)節(jié)蛋白家族[10]，其調(diào)控的目的基因參與了細菌的毒力、新陳代謝、運動性、抗氧化、黏附和分泌等[11]。前期研究中，課題組在患化膿性肺炎和腹瀉林麝的腸道中分離出1株肺炎克雷伯氏菌，該菌株對小鼠具有強致病性，全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，該菌株基因組序列中有1段序列大小為909 bp的編碼序列（登錄號：KX026659），命名kp05372，通過生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)，該基因為1個新的LysR家族轉(zhuǎn)錄因子，可能具有LysR家族轉(zhuǎn)錄因子相似的功能[12]。因此，本研究擬通過對該基因進行原核表達，以期為該基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與質(zhì)粒

林麝源肺炎克雷伯氏菌菌株由筆者所在實驗室保存;感受態(tài)大腸桿菌DH5α和BL2（DE3），購自天根生化科技有限公司;克隆載體pMD19-T sample載體，購自大連TaKaRa公司;表達載體 pET-32a（+） 為筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒及DNA Marker（DL2000）、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、Western Blot試劑盒;限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、EcoRⅠ、D2000 plus DNA ladder、Trans 2K plus ⅡDNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、DNA T4連接酶、PVDF膜、考馬斯亮藍R250、IPTG和2×SDS凝膠上樣緩沖液、抗His標簽單克隆抗體、二抗（兔抗鼠）等。

1.3 pMD19-T/kp05372重組克隆載體構(gòu)建與鑒定

運用Primer 5.0和Oligo 6.0設計擴增kp05372基因的特異性引物（P1：5′-GGTACCATGAACGGGATCAGTTTCAACC-3′，下劃線堿基為KpnⅠ酶切位點;P2：5′-GAATTCTTAGCTGCGACGCTCCTG-3′，下劃線堿基為EcoRⅠ酶切位點）。以GPKP菌株DNA為模板，進行kp05372基因的PCR擴增。PCR反應體系為：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol/L P1引物1.0μL，10 mmol/L P2引物 1.0 μL，DNA模板 10 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將擴增產(chǎn)物進行電泳、膠回收和測序，測序結(jié)果與目標序列進行比對、驗證，然后利用T4連接酶將其與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，然后取100 μL涂于含0.1 mg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩16 h。隨后分別提取質(zhì)粒，以P1、P2為引物，進行PCR和用KpnⅠ、EcoRⅠ單、雙酶切驗證。

1.4 pET-32a（+）/kp05372重組表達質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

利用KpnⅠ和EcoRⅠ酶對重組克隆質(zhì)粒pMD19-T/kp05372和表達質(zhì)粒pET-32a（+）雙酶切。pMD19-T/kp05372質(zhì)粒37 ℃酶切2 h，pET-32a（+） 質(zhì)粒37 ℃酶切12 h，電泳分離酶切產(chǎn)物，然后膠回收目的片段，16 ℃連接過夜。連接反應體系如下：目的片段5.0 μL;pET-32a（+）片段1.0 μL;T4 Ligase 0.5 μL;T4 Ligase Buffer 1.0 μL;H2O 2.5 μL。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coli DH5α，涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別挑取陽性克隆菌株，提取質(zhì)粒進行PCR和KpnⅠ、EcoRⅠ單、雙酶切驗證，對鑒定正確的重組表達質(zhì)粒送公司進行測序。

1.5 重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

將pET-32a（+）/kp05372重組質(zhì)粒陽性E.coli BL21（DE3）接種于含0.1 mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃溫度振蕩培養(yǎng)至D600 nm約為0.6，分別加入IPTG至終濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，誘導培養(yǎng)4 h，各取菌液 1 mL。同時，取部分IPTG濃度為0.6 mmol/L菌液離心，收集上清，用Tris-HCl（pH值=8.0）洗滌沉淀，超聲波裂解菌體，離心，收集沉淀。同時，在IPTG濃度0.6 mmol/L組設置28、30、37 ℃溫度梯度及1、2、3、4、5、6、7、8、9 h的誘導時間梯度。最后，分別在0.6 mmol/L菌液上清、裂解上清、裂解沉淀、不同IPTG濃度菌液、不同誘導時間菌液、不同溫度梯度菌液沉淀樣品中，加入25 μL PBS和 25 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，混勻后沸水煮 5 min，10 000 r/min 離心1 min，取10 μL上層液體SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍R250染色后脫色，利用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達情況。同時，設置誘導的空載體pET-32a（+） BL21（DE3）轉(zhuǎn)化菌作為對照。