韓曉靜，林 牧，陶 雪，龔亞東，唐 竹，陳云華，馬慶慶

(貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州 遵義 563000)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculoss，MTB)感染引起的慢性傳染病[1]，已成為全球單因致死率最高的傳染病[2]。近年致死率極高的耐藥結(jié)核患者不斷增多，與早期診斷及防控的薄弱和不足等原因密切相關(guān)。目前羅氏培養(yǎng)+藥敏試驗是檢測MTB耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在周期長、準(zhǔn)確性較低、靈敏度差等缺點[3-4]，遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。隨著MTB耐藥分子機(jī)制研究的深入，目前已明確MTB的rpoB、inhA、katG、rpsL、embB等基因突變與結(jié)核耐藥有關(guān)[5-8]?；蛐酒夹g(shù)具有快速、準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好、通量高等特點，可應(yīng)用于MTB耐藥基因的檢測[7-8]。本研究應(yīng)用PCR-反向點雜交技術(shù)(膜芯片技術(shù))對MTB與利福平(rifampicin，RFP)、異煙肼(isoniazid，INH)、鏈霉素(streptomycin，SM)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)耐藥相關(guān)的突變基因進(jìn)行檢測，與藥敏培養(yǎng)比例法檢測結(jié)果進(jìn)行分析對比，探討PCR-反向點雜交法(膜芯片法)在MTB耐藥快速檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般材料：選取2017年11月～2018年11月間在我院就診的441例菌陽性肺結(jié)核患者，其中男276例，女165例，年齡13～88歲，平均(41.25±5.56)歲。納入病例均符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)會《肺結(jié)核診斷和治療指南》、《臨床診療手冊(結(jié)核病分冊)》、《結(jié)核病防治手冊(菌陽肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn))》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，性別、年齡隨機(jī)分布。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物的患者；②孕婦或哺乳期婦女；③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。

1.2主要儀器設(shè)備：分枝桿菌核酸檢測試劑盒(北京博奧，中國)，結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法，深圳亞能)，YN-H16型恒溫雜交儀(深圳亞能)，2720 Thermal Cycler PCR儀(ABI)等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集：同時采集菌陽性肺結(jié)核患者深部晨痰5 ml以上，置于2個無菌50 ml離心管中(一份進(jìn)行MTB-DNA提取，另一份進(jìn)行MTB培養(yǎng)及藥敏試驗)，密封，當(dāng)日檢測。

1.3.2MTB培養(yǎng)及比例法藥物敏感試驗：采用羅氏培養(yǎng)比例法進(jìn)行藥物敏感實驗，試驗方法嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》、《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》操作。4種抗結(jié)核藥物的低濃度、高度濃度標(biāo)準(zhǔn)：利福平濃度為50 μg/ml、250 μg/ml，異煙肼濃度為1 μg/mL、10 μg/ml，鏈霉素濃度為10 μg/ml、100 μg/ml，乙胺丁醇濃度為5 μg/ml、50 μg/ml，只要對一種濃度耐藥即可認(rèn)為該樣本對此藥物耐藥。

1.3.3痰液MTB-DNA提取及PCR擴(kuò)增：痰液加入NaOH溶液搖勻液化，液化后痰液按北京博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行MTB-DNA的提取。取4 μl上清液(MTB-DNA)于PCR管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按深圳亞能生物技術(shù)有限公司結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒說明書的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.4反向點雜交及結(jié)果判讀：取檢測膜條置于15 ml離心管中，加PCR產(chǎn)物，雜交按深圳亞能結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行，膜條避光顯色，出現(xiàn)藍(lán)色斑點即為含有相應(yīng)的待檢基因，尼龍膜條芯片上探針排列見表1。

1.3.5耐藥類型定義：單耐藥：對一種抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥：對一種以上抗結(jié)核藥物耐藥(除同時耐利福平和異煙肼外)；耐多藥(MDR-TB)：至少對利福平和異煙肼耐藥[9]。

1.4統(tǒng)計數(shù)據(jù)：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用率(%)表示，以培養(yǎng)加藥敏法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用χ2檢驗比較各組耐藥率、敏感度、特異度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)，P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。一致性檢驗用Kappa檢驗，Kappa >0.8為兩者一致性非常好；0.6

表1 膜芯片上探針位點排布圖

N1N2N3N4N5D516VD516GH526YH526DS531LS531W315N-15N43N88N306NCC315M-15M43M88M306M1306M2

注： N1～N5代表利福平rpoB基因507～533位密碼子為野生型，315N、-15N代表異煙肼katG基因第315、inhA基因第15密碼子位點為野生型，3N、88N代表鏈霉素rpsL基因第43、88密碼子位點為野生型，306N代表乙胺丁醇embB基因第306密碼子位點為野生型。D516V、D516G、H536Y、H536D、S531L、S531W代表利福平rpoB基因相應(yīng)位點突變，315M、-15M代表異煙肼katG、inhA基因相應(yīng)位點突變，443M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應(yīng)位點突變，306M1、306M2代表乙胺丁醇embB基因相應(yīng)位點突變

2 結(jié)果

2.1四種抗結(jié)核藥物耐藥檢出情況：以培養(yǎng)+藥敏法測定的耐藥結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，膜芯片法對利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥檢出率、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別見表2。441例樣本中膜芯片法檢出利福平耐藥59例(13.38%)、異煙肼耐藥69例(15.65%)、鏈霉素耐藥53例(12.02%)、乙胺丁醇耐藥28例(6.35%)。兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，一致性檢驗顯示Kappa均>0.7，即膜芯片法與培養(yǎng)+藥敏法對四種藥物耐藥的檢出一致性較好。

表2 四種抗結(jié)核藥物耐藥檢出情況(n=441)

藥物名稱膜芯片法藥敏法(例)耐藥 敏感靈敏度(%)特異度(%)準(zhǔn)確度(%)Kappa值P值利福平耐藥55490.1698.9597.730.9040.754敏感6376異煙肼耐藥65485.5398.9097.510.8760.118敏感11361鏈霉素耐藥48582.7698.6996.600.8450.302敏感10378乙胺丁醇耐藥2177098.3096.370.7050.804敏感9404

2.2MTB耐藥類型比較：膜芯片法和培養(yǎng)+藥敏法檢測441例樣本，檢出總耐藥、單耐藥、多耐藥和耐多藥例數(shù)及耐藥率見表3，兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 膜芯片法和藥敏法檢出MTB耐藥類型[例(%)，n=441]

耐藥類型膜芯片法藥敏法P值單耐藥54(12.24)59(13.38)0.994多耐藥23(5.22)26(5.90)0.991耐多藥34(7.71)35(7.94)0.998合計111(25.17)120(27.21)0.966

3 討論

目前MTB對利福平和異煙肼耐藥的分子機(jī)制相對明確，利福平耐藥相關(guān)突變主要集中在rpoB基因核心區(qū)一段長約81bp的片段上[10]，該區(qū)域突變率達(dá)95%以上[11-12]。異煙肼耐藥突變基因主要是katG和inhA基因(70%左右)[7,13-14]。鏈霉素的耐藥與編碼核糖體S12蛋白的rpsL基因和編碼16SrRNA的rrs基因突變有關(guān)[15]，耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因embB基因突變有關(guān)，embB基因長約3246bp[16]，其余尚未明確。本研究所用的膜芯片探針幾乎已覆蓋利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因。

以培養(yǎng)+藥敏法測定的MTB耐藥結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，本研究用膜芯片法檢測利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥性的靈敏度良好、特異度極高、準(zhǔn)確度較高，兩種方法對4種抗結(jié)核藥耐藥的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且一致性較好(Kappa>0.7)，尤以利福平最高，因膜芯片覆蓋的rpoB基因探針較全(95%以上)。而MTB乙胺丁醇耐藥率、靈敏度及一致性較其他3種藥物更低，與其耐藥突變基因的相關(guān)研究并未明確有關(guān)，加之embB基因片段較長，現(xiàn)有膜芯片更是無法完全覆蓋。

綜上所述，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)+藥敏試驗相比，膜芯片法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的快速檢測具有較高敏感度、高特異度和高準(zhǔn)確度、操作簡便、快速(僅需1 d)的優(yōu)勢，因此膜芯片技術(shù)檢測結(jié)核桿菌耐藥基因可作為實驗室輔助檢查手段，對指導(dǎo)臨床進(jìn)行有效、快速的抗結(jié)核治療，具有重要應(yīng)用價值。