丁 寧，周奧飛，章林明，李 麗，王勤章，李應(yīng)龍

(石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷屬于較為常見的臨床損傷，而作為高灌注器官的腎臟，特別容易在I/R過(guò)程中受到損害。缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指機(jī)體通過(guò)灌注血液后，原本缺血的狀態(tài)雖然得以改變，但是缺血組織并未恢復(fù)正常的代謝功能，反而因?yàn)槿毖嘧⒍鴮?dǎo)致?lián)p傷加劇，出現(xiàn)水腫、充血、纖維化等病理改變[1]。此種損傷常出現(xiàn)于休克后復(fù)蘇、腎部分切除術(shù)、腎積水、腎移植手術(shù)、腎臟動(dòng)脈血管成形術(shù)、選擇性尿路手術(shù)、腎腫瘤切除術(shù)等[2]。腎臟在缺血再灌注損傷過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞是損傷最為嚴(yán)重的部位。近年來(lái)，許多文章表明，腎IRI晚期可發(fā)生腎臟纖維化[3-4]。目前常見的急慢性腎臟疾病晚期大都伴隨著纖維化病變。IRI對(duì)腎臟遠(yuǎn)期損害顯著，主要是對(duì)其功能的影響。如在腎移植術(shù)后，移植腎失去功能、腎臟纖維化以及急性或慢性排斥反應(yīng)。所以改善IRI對(duì)腎移植后移植物遠(yuǎn)期影響的重要方式之一就是延緩或者減輕纖維化這一過(guò)程，在其他臟器移植手術(shù)后，減輕纖維化亦可增加移植物的存活率[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在腎纖維化進(jìn)程中起到重要作用，在纖維化形成、細(xì)胞增殖、凋亡、肥大過(guò)程中都有發(fā)揮作用[6]。TGF-β是一種分布十分廣泛、可在機(jī)體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞生成的一種具備多向調(diào)節(jié)能力的生長(zhǎng)因子，并且有多達(dá)5種同分異構(gòu)體，其中在人體中所占比例最高且活性最強(qiáng)的是TGF-β1[7]。腎間質(zhì)纖維化的主要病理改變是正常組織被腎細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)所取代[8]，TGF-β1的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)這一過(guò)程的發(fā)展。有實(shí)驗(yàn)證明，其通過(guò)增加腎小球系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，從而促進(jìn)纖維化的進(jìn)展[9]。實(shí)驗(yàn)證明TGF-β1的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和近曲小管上皮細(xì)胞等細(xì)胞ECM的合成，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化[10]。在腎臟進(jìn)行性纖維化過(guò)程中，TGF-β1是造成纖維化的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，同時(shí)TGF-β1的表達(dá)水平可間接反映腎臟的纖維化[11]。

雌激素是一種生物效能非常廣泛的類固醇激素，MARIC等提出其抗纖維化作用機(jī)制主要在于其參與膠原、系膜基質(zhì)的合成與降解[12]。但是在腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)病變過(guò)程中，對(duì)于此類固醇激素抑制纖維化的機(jī)制尚不明確。17-β雌二醇(E2)是雌激素的主要活性成分。本研究通過(guò)大鼠動(dòng)物手術(shù)造模模擬體內(nèi)缺血/再灌注模型，并通過(guò)雌激素干預(yù)，檢測(cè)干預(yù)組與對(duì)照組之間的病理變化、纖維化水平和TGF-β1表達(dá)變化，以此探究雌激素對(duì)腎缺血再灌注損傷后纖維化過(guò)程中所發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取32只雌性SD大鼠，體重250～300 g，周齡8～12周，分為4組，每組8只。動(dòng)物房室內(nèi)溫度及濕度合適，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，進(jìn)食水未干預(yù)，室內(nèi)環(huán)境適合，正常飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器：17β-雌二醇；Masson實(shí)驗(yàn)試劑；兔源多克隆TGF-β1抗體(Abcam公司)；β-actin 一抗、羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備：實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為32只雌性SD大鼠，根據(jù)已報(bào)道的雌激素干預(yù)研究動(dòng)物模型進(jìn)行造模[13]。實(shí)驗(yàn)前先對(duì)大鼠進(jìn)行去卵巢處理，具體流程如下：首先麻醉大鼠，準(zhǔn)備手術(shù)消毒、備皮、鋪巾工作，以腹部正中為切入口，刀口從恥骨聯(lián)合上方1 cm到劍突下方，將暴露后的雙側(cè)卵巢切除后，縫合傷口。手術(shù)后，喂養(yǎng)2周可正式開始研究實(shí)驗(yàn)。每組8只，共4組，分組如下：第一組為正常組(control組)，該組大鼠不采取任何措施；第二組為假手術(shù)組(Sham組)，對(duì)大鼠腹部注入戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，術(shù)區(qū)備皮、碘伏擦拭、鋪蓋無(wú)菌洞巾，以腹部正中作為切入口，刀口從恥骨聯(lián)合上方1 cm到劍突下方，暴露雙側(cè)腎臟后，將右側(cè)腎臟切除，不做夾閉左側(cè)腎蒂，手術(shù)持續(xù)約45 min后關(guān)閉腹腔；第三組為缺血再灌注損傷組(L/R組)，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉并剔除腹部毛發(fā)，用碘伏對(duì)腹部手術(shù)位置進(jìn)行消毒處理，以腹部正中作為切入口，刀口從恥骨聯(lián)合上方1 cm到劍突下方。與假手術(shù)組同方式處理右側(cè)腎臟，但是左側(cè)腎蒂采用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，觀察大鼠腎臟顏色是否發(fā)生變化，當(dāng)鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色時(shí)說(shuō)明缺血成功，反之則表明手術(shù)失敗。45 min后，去除左側(cè)腎蒂的無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾，恢復(fù)腎臟灌流；第四組為17β-雌二醇預(yù)處理干預(yù)組(E2+I/R組)，術(shù)前3 d連續(xù)給予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)皮下注射，第4天進(jìn)行手術(shù)，其余處理同I/R組。為模擬I/R組和E2+I/R組雌激素注射，用等量的生理鹽水分別注入Control 組和 Sham 組大鼠腹腔內(nèi)。所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，斷頸處死后解剖剝離腎臟。

1.3.2蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色：剝離后的大鼠腎臟沿縱向切開，等量分成兩部分，一部分儲(chǔ)存于-80℃，另一部分浸泡在福爾馬林中固定24 h后，使用石蠟包埋處理，切片，HE染色液進(jìn)行染色，通過(guò)顯微鏡觀察切片中組織病理形態(tài)的變化。將腎小管間質(zhì)組織損傷程度用Paller法表示出來(lái)：使用光學(xué)顯微鏡，在200倍視野下，隨機(jī)觀察10個(gè)腎小管，對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，具體評(píng)分依據(jù)：腎小管管徑增加、細(xì)胞形態(tài)改變計(jì)1分；刷狀緣改變計(jì)1分，脫落計(jì)2分；管型計(jì)2分，腎小管管腔內(nèi)有脫落壞死的細(xì)胞計(jì)1分。

1.3.3Masson染色：組織固定液處理后腎組織乙醇脫水，石蠟包埋，切片，將切片經(jīng)馬松染色處理，光鏡下觀察各組腎組織纖維化改變情況。

1.3.4Western blot 法檢測(cè)腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平：將腎臟組織放入液氮中研磨，并用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA對(duì)研磨后的組織進(jìn)行裂解，將組織總蛋白分離出來(lái)，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量并加入4xLoading Buffer，95℃加熱10 min進(jìn)行預(yù)變性，對(duì)所取樣的蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜操作，再用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，經(jīng)過(guò)TGF-β1及β-actin一抗孵育過(guò)夜(濃度為1∶1 000)，TBST洗三遍，室溫孵育HRP連接二抗1 h(濃度1∶3 000)，使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光、拍照，應(yīng)用ImageJ分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：通過(guò)SPSS22.0軟件來(lái)處理相關(guān)數(shù)據(jù)信息，用繪圖來(lái)代表，運(yùn)用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Turkey多重檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腎組織病理學(xué)檢查及組織Paller評(píng)分：基于Paller法評(píng)分，Control組、Sham組：腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化；I/R組腎小球結(jié)構(gòu)明顯變化，出現(xiàn)萎縮，腎小管出現(xiàn)腫脹、壞死及細(xì)胞脫落，管腔大小明顯改變、腎間質(zhì)均出現(xiàn)了病理變化，Paller評(píng)分較Sham組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E2+I/R組腎小球結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較I/R組輕，Paller評(píng)分較I/R組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。圖A-c黑色箭頭為較典型的腎小管病理變化。

2.2Masson染色后各組腎組織纖維化改變情況：細(xì)胞外膠原纖維呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。觀察可見Control組、Sham組大鼠腎小管上皮細(xì)胞均勻排布，腎小囊、小管基底膜腎小球系膜與血管周圍藍(lán)染區(qū)均較少；I/R組腎小管間質(zhì)出現(xiàn)大量膠原堆積；E2+I/R組雖然有少量藍(lán)色膠原堆積，但較I/R組少。見圖2。

2.3Western blot 法檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)：通過(guò)imageJ將TGF-β1與β-actin條帶灰度值進(jìn)行相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)，I/R 組TGF-β1較Sham組要表達(dá)水平高;E2+I/R組的蛋白表達(dá)要比I/R組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

a. control組；b.sham組；c.I/R組；d.E2+I/R組

a.control組；b.sham組；c.I/R組；d.E2+I/R組

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)量變化

3 討論

腎臟作為機(jī)體血液高灌注器官之一，在很多疾病或術(shù)式中易受到缺血再灌注損傷，如腎移植、腎部分切除等。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，主要涉及腎小球和腎小管功能的損傷，近年許多研究已證明，缺血再灌注損傷后期可出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化[15]。腎臟疾病如果不及早進(jìn)行控制，發(fā)展到最后就會(huì)演變成腎間質(zhì)纖維化，最終會(huì)造成腎衰竭。之所以會(huì)出現(xiàn)腎臟纖維化，是因?yàn)闆]有對(duì)慢性腎病重視起來(lái)并未控制其發(fā)展。在各種疾病不斷發(fā)展后期常見病理變化為細(xì)胞外基質(zhì)堆積(ECM)，健康細(xì)胞由新生的ECM充當(dāng)，造成一系列難以逆轉(zhuǎn)的腎臟疾病[16]。本課題以大鼠夾閉腎蒂45 min后恢復(fù)灌注來(lái)模擬缺血-再灌注損傷，可以反映出腎移植期間的缺血情況。根據(jù)HE及Masson染色結(jié)果，I/R組大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫大、壞死、萎縮；間質(zhì)也出現(xiàn)了纖維化，說(shuō)明造模成功。

研究證實(shí)，TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是影響腎間質(zhì)纖維化的主因素之一[17]。臨床研究表明，腎小球出現(xiàn)硬化、間質(zhì)纖維化與TGF-β1信號(hào)通路的激活密切相關(guān)[18]。TGF-β1一方面對(duì)系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生大量ECM堆積；另一方面它增加蛋白酶抑制因子的合成，使ECM無(wú)法降解。TGF-β1的過(guò)度表達(dá)就會(huì)造成腎小球與小管間質(zhì)系列問(wèn)題，最終使其向纖維化等方向演變。TGF-β1可參與許多與腎間質(zhì)纖維化有關(guān)的反應(yīng)，涵蓋加速基質(zhì)的合成、抑制基質(zhì)的降解、上調(diào)整合素基質(zhì)黏附分子的表達(dá)從而趨化成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞到達(dá)損傷部位。腎臟瘢痕出現(xiàn)期間，因TGF-β1導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)越來(lái)越多，組織受到的侵害也越來(lái)越嚴(yán)重。研究顯示，對(duì)TGF-β1的生物活性進(jìn)行控制，可以有效減少細(xì)胞外基質(zhì)成分，對(duì)纖維化的控制也有顯著效果[19-20]。

之前的研究已經(jīng)證實(shí)，人體纖維化疾病的發(fā)展因性別而有區(qū)別：女性比男性更抗纖維化[21]；與男性及絕經(jīng)后婦女相比，絕經(jīng)前婦女患嚴(yán)重肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)較低[22]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，雌激素能抑制多個(gè)器官的細(xì)胞和纖維化的激活，包括肝臟、心肺和腎臟[23-24]。雌激素是一種具有廣泛生物活性的類固醇激素，臨床顯示，雌激素對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)以及腎內(nèi)、外血流動(dòng)力學(xué)有一定的作用，從而調(diào)節(jié)腎小球功能，減輕灌注壓力；對(duì)VEGF的表達(dá)有促進(jìn)作用，增加系膜細(xì)胞的活性，使細(xì)胞外基質(zhì)合成表達(dá)能力降低，同時(shí)對(duì)抗氧化劑與脂代謝等，具有調(diào)節(jié)功能，減輕腎功能受害程度[25]。雌激素可以緩解腎組織的損傷程度，使ECM成分盡可能控制在一定范圍內(nèi)，對(duì)腎間質(zhì)纖維化起到控制作用；作用于TGF-β1可以改變其活性從而使其表達(dá)受限，可以一定程度上抑制上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，有效抑制ECM的合成，從而使病變腎組織ECM合成減少，降解增加，從而延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

本次研究表明，雌激素會(huì)緩解缺血再灌注損傷大鼠腎間質(zhì)纖維化，且減少TGF-β1的表達(dá)水平，由此推測(cè)雌激素可通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)來(lái)降低纖維化，但其詳細(xì)的機(jī)制還需要更深一步研究。

隨著泌尿外科術(shù)式不斷進(jìn)步與發(fā)展，傳統(tǒng)根治性腎切除被保留腎單位手術(shù)所取代，隨著腎移植手術(shù)的不斷進(jìn)步，腎缺血再灌注損傷所帶來(lái)的問(wèn)題就愈發(fā)明顯。終末期腎病較常采用的治療方法之一就是腎移植，但是移植過(guò)程中易出現(xiàn)缺血再灌注損傷。如何降低腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的移植物遠(yuǎn)期功能異常也成為腎移植領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)為腎臟缺血再灌注損傷的防治提供依據(jù)，也為其他纖維化腎臟疾病的臨床治療提供新思路。