董 方 陳 東 商建峰 方 微 滕 飛 張睿祺

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科，北京 100029)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是感染率較高的致病菌，與慢性胃炎、胃潰瘍及胃癌等消化系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展均相關(guān)，1994年被國際癌癥研究中心列為Ⅰ類致癌物，發(fā)現(xiàn)并根除Hp可治愈或延緩上述疾病[1-3]。研究[4]顯示，全球人群Hp感染率高達(dá)50%，防治Hp感染是一個嚴(yán)峻且迫在眉睫的公共衛(wèi)生問題。研究[5-6]顯示Hp的毒力差異因菌株亞型不同而不同，Ⅰ型Hp菌株含有CagA基因，即細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白，表達(dá)CagA和VacA，為高毒力菌株；Ⅱ型Hp為不產(chǎn)生細(xì)胞毒素菌株，即CagA和VacA陰性株，為低毒力菌株；因此Ⅰ型感染主張根除治療，部分Ⅱ型感染者可暫不抗菌治療，隨訪觀察，分子分型同時也與菌株的耐藥性相關(guān)。目前關(guān)于Hp的檢測方法有很多種，如13C尿素呼氣試驗、血清學(xué)檢測、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測、快速尿素酶及細(xì)菌培養(yǎng)方法[7]，各種檢測方法均有其局限性及其優(yōu)勢。TaqMan分子探針法檢測作為一種新的檢測Hp技術(shù)，其特異度及靈敏度均優(yōu)于其他檢測技術(shù)，而且可以通過分子檢測對Hp分子進(jìn)行分型[8]，對感染程度進(jìn)行分級，從而可以更好地指導(dǎo)臨床治療。本研究將通過統(tǒng)計接受首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院Hp分子檢測的患者，篩選出Hp陽性的人群，鑒別I型和Ⅱ型，并對不同月份、不同季節(jié)及不同年齡段的感染率進(jìn)行對比分析，了解門診消化道疾病患者人群的Hp感染現(xiàn)狀，并對相關(guān)影響因素進(jìn)行分析，為本地區(qū)制訂有效的Hp防治方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年4月至2019年9月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院就診的消化系統(tǒng)疾病患者10 839例為研究對象，年齡15～89歲，入選患者均有明顯的胃腸道癥狀，以胃部不適就診且接受胃腸鏡活檢。排除1個月內(nèi)接受過抗 Hp、抗菌藥物及H2 受體拮抗劑治療者。

1.2 研究方法

1)樣本：選取患者胃黏膜活檢組織蠟塊，組織切片厚度為4～6 μm，數(shù)量10片，混合后用于DNA提取。

2)DNA提?。菏褂玫聡鳴iagen公司的石蠟組織DNA提取試劑盒(貨號56404)進(jìn)行DNA提取。所檢測的DNA需要紫外分光光度計測定，濃度大于10 mg/μL,A260 nm/A280 nm應(yīng)在1.7～2.2。

3)Hp陰陽性及感染強(qiáng)度的判斷： Hp核酸檢測試劑盒[熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法]購自北京新基永康生物科技有限公司，該試劑盒針對Hp的UreA基因設(shè)計特異引物和Taqman熒光探針進(jìn)行PCR檢測，利用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線法確定本試劑盒的陽性判斷值為35.00，即待檢樣本的FAM熒光Ct值≤35.00為陽性，Ct值>35.00或Undetermined為陰性。對于鑒定為陽性的Hp,△Ct>3.00，為輕度感染+，0<△Ct<3.00，中度感染++，△Ct≤0.00，重度感染+++。

4)Hp的分子分型鑒定：使用Ⅰ型幽門螺桿菌核酸檢測試劑盒(北京新基永康生物科技有限公司)對分型進(jìn)行鑒定，該試劑盒針對Hp基因組中是否含有CagA基因?qū)p分為兩型。Ⅰ型Hp,即CagA(+)，PCR結(jié)果顯示Ct值≤35.00,內(nèi)標(biāo)RNP≤35；Ⅱ型Hp，即CagA(-)，PCR結(jié)果顯示Ct值>35.00或Undetermined,內(nèi)標(biāo)RNP≤35。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料計算百分率，組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消化系統(tǒng)疾病患者Hp感染的年齡、性別分布

10 839例研究對象中，陽性3 659例，陽性檢出率為33.76%，其中男性陽性檢出率為34.9%，女性為32.7%，性別間陽性檢出率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。青少年陽性檢出率較低(29.27%)，隨著年齡的增加陽性檢出率增高，31～40歲陽性檢出率達(dá)到最高(40.76%)，后呈逐漸降低的趨勢，年齡組間陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 10 839例受檢者Hp檢出情況分析

Hp:Helicobacterpylori.

2.2 消化系統(tǒng)疾病患者Hp感染的季節(jié)及月份分布

圖1顯示，消化系統(tǒng)疾病患者Hp的陽性檢出率在每年夏季(6、7、8月份)最高，檢出率為39.02%，明顯高出其他季節(jié)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

圖1 Hp在不同月份的感染率分析

2.3 消化系統(tǒng)疾病患者感染的Hp分子分型分布

分子分型為Ⅰ型的病例共3 285例，占總陽性例數(shù)的89.78%，其中男性1 663例，女性1 622例。分子分型Ⅱ型的374例，占總陽性例數(shù)的10.22%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Ⅰ型的檢出率。根據(jù)嚴(yán)重程度不同，分為輕+，中(++)，重(+++)三型，Ⅰ型中度感染程度的人數(shù)較多為1 892例；Ⅱ型輕度感染程度的人數(shù)較多，為199例。男性I型的檢出率較女性高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅱ型檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表2 不同季節(jié)Hp感染情況比較

χ2=38.152，P=0.000Hp:Helicobacterpylori.

表3 不同性別感染Hp分子分型及嚴(yán)重程度的比較

TypeⅠ：χ2=9.497，P=0.002； type Ⅱ：χ2=2.156，P=0.142;Hp:Helicobacterpylori.

3 討論

幽門螺桿菌是多種消化系統(tǒng)疾病的致病因素，其引起胃病的發(fā)生機(jī)制主要包括以下幾個方面：① Hp感染后導(dǎo)致胃泌素與生長抑素失衡，引起胃酸分泌異常；其代謝產(chǎn)物NO等誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡的增加可能與胃炎、胃潰瘍的發(fā)生機(jī)制相關(guān)[9]。② Hp分泌的毒力因子，毒素相關(guān)基因A可導(dǎo)致胃黏膜受損[10]；同時Hp會刺激加速腫瘤壞死因子與白介素的釋放，加劇炎性反應(yīng)的發(fā)生。③Hp是一種硝酸鹽還原劑，能夠促進(jìn)硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起胃黏膜出現(xiàn)癌變[11];④ Hp感染造成的患者胃黏膜慢性炎使得黏膜上皮細(xì)胞增生加快，造成黏膜上皮細(xì)胞過度增生，從而引發(fā)畸變導(dǎo)致癌癥[12]。

影響幽門螺桿菌感染的相關(guān)的因素有很多，比如飲食、性別、抽煙、季節(jié)等[13-14]。在本文中筆者著重探討了檢出率在不同性別、不同年齡段及不同季節(jié)的差別，本文的研究顯示男性胃腸道疾病患者的Hp感染率高于女性，這可能與男性嗜好飲酒、抽煙有關(guān)，且已有研究[15-16]表明飲酒抽煙可以影響Hp的感染率；其次本研究顯示其感染率與患者的年齡及季節(jié)有關(guān)?；颊咴?0～40歲年齡段檢出Hp的數(shù)量最多，推測可能與此年齡段的患者由于工作性質(zhì)在外就餐機(jī)會比較多，容易感染Hp。另外Hp的檢出率在6、7、8月份較高可能是由于6、7、8月份是每年中最熱的季節(jié)，人們的飲食習(xí)慣發(fā)生改變，會較多食用一些生冷食品、燒烤制品、啤酒以及聚餐引起的交叉感染；除此之外，這三個月的溫度和濕度使Hp容易在食物中存活，導(dǎo)致Hp通過食物感染患者的概率增大。

目前國內(nèi)外關(guān)于Hp的檢測方法有很多種，包括非侵入性檢測和侵入性檢測，非侵入性檢測方法包括13C-尿素呼氣實驗、血清學(xué)方法檢測，唾液和糞便的PCR檢測；侵入性的檢測方法包括快速尿素酶實驗，免疫組織化學(xué)檢測，細(xì)菌培養(yǎng)/藥敏試驗以及本研究所采用的胃鏡活檢組織DNA探針/PCR檢測方法。在非侵入檢測方法，13C-尿素呼氣實驗是其中比較可靠、簡便的方法，而且靈敏度高，是大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)最普遍開展的檢測方法，但其檢測容易受多種因素影響，特異度較低。免疫組織化學(xué)檢測作為侵入性檢查的一種常用方法，其靈敏度及特異度均較高，但是診斷者之間判斷差異較大，而且所需時間較長。本研究所采用的TaqMan探針法分子檢測作為一種侵入性檢查的新的檢測技術(shù)，對Hp的UreA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Ct值及△Ct值對Hp是否感染及感染程度進(jìn)行判斷，其特異度及靈敏度均優(yōu)于其他檢測技術(shù)，更重要的是可以通過對Hp基因組中是否含有CagA基因?qū)p分為高毒力菌株及低毒力菌株兩型，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師用藥，有效預(yù)防耐藥對治療產(chǎn)生的不良影響。

本研究顯示個別分子檢測Hp的檢出結(jié)果與13C呼氣試驗檢出結(jié)果不同，可能是因為13C呼氣試驗檢測的是整個胃黏膜幽門螺桿菌的感染情況，而胃鏡檢測的是某一部位Hp的感染情況，取材的局限性可能會造成不能完全反映整個胃黏膜的情況，所以在取材的時候要在病變部位多點取材。另外13C呼氣容易受到多種因素的影響，靈敏度高，特異度較低，這也可能是造成其檢出結(jié)果不同于分子檢測的原因[17-18]，所以在臨床實踐中，遇到這種情況，通?？梢越Y(jié)合免疫組織化學(xué)及組織學(xué)檢查的方法對患者做出準(zhǔn)確的診斷。

綜上，針對易導(dǎo)致Hp感染的因素，應(yīng)積極預(yù)防，避免和減少Hp感染的發(fā)生；臨床上，通過分子分型檢測患者 Hp的分型結(jié)果，可以指導(dǎo)醫(yī)生更加有效地用藥治療Hp引起的胃腸道疾??；然而對于一些廣泛耐藥的Hp，希望將來可以通過基因檢測找到治療的有效靶點。