阮景晟， 陳 闖， 李科志， 黃 山， 何劍波， 曾愛屏， 連 芳， 鄔國斌

1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院， 南寧 530021

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由肝功能不全和(或)門體靜脈分流所引起的大腦功能障礙，表現(xiàn)為從輕微認知障礙到昏迷等一系列神經(jīng)精神癥狀[1-2]。HE是急慢性肝病常見的并發(fā)癥，病死率較高[3]。目前HE發(fā)病機制尚未完全闡明，也無有效的防治藥物與方法。因此，建立HE動物模型對其發(fā)病機制、診斷和治療的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)揮著重要作用[4]。HE患者臨床表現(xiàn)出一系列的運動和認知相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀，如運動能力、協(xié)調(diào)能力、運動活性等的降低[5-6]。尋找與HE發(fā)病相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)相關(guān)蛋白的改變及作用很有探索意義[7]。Sema3A是一種分泌型蛋白，其具有影響神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)軸突導向的功能[8]。Sema3A可以通過跨膜蛋白受體神經(jīng)菌毛素(neuropilins-1,NRP-1)結(jié)合形成Plex-NP復合物來誘導軸突末端的生長錐坍塌崩解來引發(fā)神經(jīng)退行性疾病，但在神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復中的作用尚未完全清楚[9-11]。國外已有研究[12]證明了去葡萄糖對大鼠神經(jīng)皮質(zhì)細胞內(nèi)Sema3A及NRP-1的作用及影響。因此，本文通過建立HE大鼠模型檢測Sema3A及其受體NRP-1的表達及變化情況，初步探討Sema3A及NRP-1參與HE病理生理過程的相關(guān)機制，為相關(guān)實驗研究及HE的臨床干預提供新的思路及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCKK桂2014-0002，動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。本研究所有動物實驗均符合中國倫理委員會的相關(guān)要求。

1.1.2 藥品及試劑 乙酸銨；Sema3A兔多克隆抗體，NRP-1兔單克隆抗體，Anti-beta Actin兔多克隆抗體(美國Abcam公司，批號分別為ab23393、ab81321、ab8227)；山羊抗兔IgG(H + L)抗體(上海碧云天公司，批號A0208)；大鼠血氨Elisa試劑盒(江蘇JSBOSSEN公司，批號BS-E12304R2);大鼠ALP、ALT、AST、TAB、Alb、TBil ELISA試劑盒(江蘇酶免公司，批號分別為MM-0217R1、MM-20436R1、MM-20437R1、MM-20428R1、MM-20429R1、 MM-20439R1)； Real-time PCR試劑盒(日本Takara公司，批號：RR820A)；引物β-Actin：上游5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游5’-AGGAA-GAGGATGCGGCAGTGG-3’；Sema3A：上游5’-TTGCTCGGGACCCTTATTGTG-3’；下游5’-CAGTGAGTCAGTGGGTCTCCATTC-3’；NRP-1：上游5’-CCCTCCTCCT-CGCAACTCCTC-3’；下游5’-CTCAAGTCGCCTGCATCCTGTC-3’。

1.1.3 儀器 SMART3.0行為學采集和分析系統(tǒng)(西班牙 Panlab 公司)；Axio Observer 3型倒置顯微鏡(德國 Carl Zeiss 公司)；Power/Pac300 型電泳儀，CelDoc2000型凝膠電泳成像分析儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠HE模型(C型)的制備 將40只SD大鼠按照體質(zhì)量、身體狀況、活動性等均衡的原則隨機分為4組：對照組，HE 1 d、15 d、30 d組，每組10只。HE模型制備：水合氯醛大鼠腹腔麻醉后，無菌操作開腹結(jié)扎大鼠膽總管，并將兩結(jié)扎之間的膽總管切除，給予膽總管切除術(shù)后大鼠連續(xù)灌胃濃度10 %的乙酸銨2周。對照組給予開腹后縫合但不進行膽管結(jié)扎和灌胃。

1.2.2 大鼠行為學檢測 利用SMART3.0行為學采集和分析系統(tǒng)在曠場中分析大鼠的行為，大鼠出現(xiàn)自主性活動減少、嗜睡、反應遲緩、共濟失調(diào)等癥狀之一，即可診斷為HE[13]。Zimmermann法[14]對大鼠分級，0 級：正常(11 分)；Ⅰ級：反應遲緩，神經(jīng)反射正常(11 分)；Ⅱ級：自主活動下降，但反射仍基本正常(10～11 分)；Ⅲ級：共濟失調(diào)(<10 分)；Ⅳ級：角膜反射消失，動物昏迷(0 分)。

1.2.3 血液生化指標及肝臟與腦組織病理學檢測 大鼠禁食12 h后水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心，取上清。檢測血清中血氨、TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP。取各組大鼠腦組織和一小塊左葉肝組織固定，包埋，切片，染色。

1.2.4 Real-time PCR檢測Sema3A及NRP-1 mRNA的表達水平 每組10只大鼠麻醉后處死，分離出大鼠腦皮質(zhì)和海馬各區(qū)，加入trizol提取RNA 進行Real-time PCR反應。2﹣△△ct用以計算mRNA的表達情況。

1.2.5 免疫組化法檢測前額葉皮層、海馬各區(qū)中Sema3A/NRP-1蛋白的表達 切片脫蠟、水化、抗原修復，封閉，一抗Sema3A(1∶300)/NRP-1(1∶200)，4 ℃孵育，辣根過氧化物酶標記，DAB顯色，封片。棕褐色或棕黃色為蛋白染色陽性表達。

1.2.6 Western Blot檢測前額葉皮層及海馬CA1、CA3、DG各區(qū)組織中Sema3A/NRP-1的表達 取各組大鼠皮層、海馬CA1、CA3、DG區(qū)組織提取蛋白。SDS-PAGE電泳，封閉1 h，一抗Sema3A，NRP-1，β-actin(均1∶1000),4 ℃孵育，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，洗膜3次。Image J軟件采集條帶灰度值，取目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值比值作為相對表達量。

比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)反射、血氨水平及HE分級的比較 對照組大鼠活動正常，感覺及神經(jīng)反射靈敏。造模組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)反射和自主活動的減弱。與對照組相比，隨著時間的延長(1 d、15 d、30 d)模型組在曠場中神經(jīng)反射等級、HE分級、血氨均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)反射評分、血氨濃度、HE分級的比較

注：與對照組比較，1)P<0.01，2)P<0.001；與HE 1 d組相比，3)P<0.001；與HE 15 d組相比，4)P<0.001。

2.2 各組大鼠血清學各生化指標檢測結(jié)果 4組間TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)，與對照組相比，模型組Alb水平隨時間的延長(1 d、15 d、30 d)明顯降低，其余指標明顯升高(P值均<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠肝臟和大腦皮層、海馬CA1、CA3、DG區(qū)的病理結(jié)構(gòu)的比較 肝臟HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞正常，無腫脹、變性、壞死等明顯病理改變。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)及小葉周邊可見纖維組織增生和炎性細胞浸潤(圖1)。對照組大鼠腦組織清晰，細胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元分布均勻;海馬CA1、CA3、DG區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，染色質(zhì)均勻，細胞排列整齊。模型組可見大腦皮層及海馬CA1、CA3、DG區(qū)大量神經(jīng)細胞核固縮變形，染色加深，細胞排列紊亂(圖2)。

2.4 造模后各腦區(qū)Sema3A及NRP-1 mRNA表達的改變 HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A及NRP-1 mRNA表達于造模后開始上調(diào)，隨著時間的延長(1 d、15 d、30 d)明顯增加，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)(表 3、4)。

表2 各組大鼠血清生化學指標結(jié)果分析

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.05。

注：a、c，對照組；b、d，HE 30 d組。

注：a、c、g、e，對照組；b、d、f、h，HE 30 d組。

2.5 大鼠各腦區(qū)Sema3A及NRP-1蛋白表達分析 免疫組化結(jié)果顯示，HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A及NRP-1呈陽性染色，Sema3A陽性染色可見于神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突，以胞膜和胞質(zhì)為主(圖3)；NRP-1陽性染色可見于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、微血管內(nèi)皮細胞，以胞質(zhì)為主，偶可見于胞核(圖4)。Western Blot 結(jié)果顯示，與對照組相比, HE組Sema3A及NRP-1蛋白表達顯著上調(diào)，隨時間延長逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)(圖5，表5)。

3 討論

HE動物模型的制備分為A型、B型、C型等[15]。其中可能接近慢性HE形成機制的是C型動物模型，其他模型均會導致肝臟的急性損傷，造成模型動物的死亡率較高，對HE模型的病理生理機制的研究帶來困擾[16-19]。本研究采用膽管結(jié)扎和以低毒性的乙酸銨灌胃的方式制備HE模型，模型動物神經(jīng)功能呈現(xiàn)隨時間延長的緩慢持續(xù)性受損，病理學觀察肝臟內(nèi)可見膽汁淤積和炎性細胞聚集的慢性肝損傷病變，腦組織內(nèi)可見大量神經(jīng)元變性，局部膠質(zhì)細胞的增生及尼氏體的固縮紊亂。且模型動物的死亡率很低，說明本實驗建立了較為可靠穩(wěn)定的HE模型，這是進行相關(guān)分子機制研究的基礎(chǔ)。

Sema3A在神經(jīng)系統(tǒng)中可以根據(jù)神經(jīng)元內(nèi)cGMP水平的改變而呈現(xiàn)雙重性的生物功能，可以作為某種化學抑制劑，抑制神經(jīng)軸突生長，或作為化學激活劑，刺激樹突頂端生長[20-22]。除了神經(jīng)系統(tǒng)以外，Sema3A在其他組織也有分布，與細胞遷徙、腫瘤生長、免疫反應及血管生成都有密切關(guān)系[23-24]。2014年Nature發(fā)表了關(guān)于神經(jīng)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Sema3A的研究成果[8]，證實了阻斷Sema3A的生成，運動神經(jīng)元無法形成正常的連接，并且半數(shù)的運動神經(jīng)元死亡。由此推斷特定區(qū)域內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)Sema3A蛋白是維持控制反射動作神經(jīng)回路的必要條件。近年來有研究[25-26]表明，在腦缺血梗死及脊髓損傷中，Sema3A在梗死灶及其周圍瘢痕區(qū)的大腦皮層和海馬組織中表達上調(diào)，呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。與此相似的是，本研究結(jié)果顯示，大鼠HE模型中隨著時間的延長，前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A蛋白表達明顯上調(diào)，提示HE的發(fā)生發(fā)展機制中可能與Sema3A蛋白的高表達有關(guān)。

NRP-1是一種跨膜受體，可以介導Sema3A的信號轉(zhuǎn)導[27]。Sema3A通過與跨膜蛋白受體NRP-1結(jié)合形成Plex-NP復合物，構(gòu)成了Sema3A信號通路第一級水平的調(diào)節(jié)，然后通過一定途徑將信號傳遞給細胞骨架肌動蛋白，使軸突生長錐和其他細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生相應的變化[28]。NRP-1表達于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞，可介導多種信號蛋白的轉(zhuǎn)導，與腦損傷、腦缺血、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成等都有密切的關(guān)系[29]。有報道[30]顯示，Sema3A與NRP-1形成的受體復合物，會使微管蛋白磷酸化，導致微管的失穩(wěn)和解聚，從而導致生長錐的崩潰及神經(jīng)功能的紊亂。本研究結(jié)果顯示，大鼠HE模型建立后NRP-1逐漸上調(diào)。結(jié)合上述結(jié)果，認為HE的發(fā)生機制可能與Sema3A/NRP-1軸的表達上調(diào)有關(guān)。

表3 大鼠各腦區(qū)Sema3AmRNA表達的改變

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

表4 大鼠各腦區(qū)NRP-1mRNA表達的改變

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

圖3 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)不同時間Sema3A的表達改變(免疫組化染色，×400)

圖4 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)不同時間NRP-1的表達改變(免疫組化染色，×400)

注：a，前額葉皮層；b，海馬CA1區(qū)；c，海馬CA3區(qū)；d，海馬DG區(qū)。

表5大鼠前額葉皮層和海馬中Sema3A和NRP-1蛋白表達的定量分析

組別動物數(shù)(只)前額葉皮層Sema3A NRP-1CA1區(qū) Sema3A NRP-1 CA3區(qū)Sema3A NRP-1DG區(qū) Sema3A NRP-1 對照組100.11±0.020.40±0.040.51±0.040.34±0.030.44±0.03 0.23±0.03 0.22±0.02 0.42±0.03HE 1 d組100.19±0.021)0.67±0.041)0.70±0.021)0.65±0.041)0.54±0.341)0.30±0.031)0.32±0.031)0.56±0.031)HE 15 d組HE 30 d組10100.29±0.011)2)0.76±0.051)2)3)0.89±0.341)2)1.35±0.061)2)3)0.99±0.071)2)1.41±0.031)2)3)0.75±0.031)2) 0.98±0.051)2)3)0.61±0.051)2)1.00±0.071)2)3)0.53±0.031)2)0.64±0.041)2)3)0.64±0.031)2)0.86±0.041)2)3)0.72±0.041)2) 1.06±0.101)2)3)F值835.14876.59774.16472.48282.60402.36856.29207.47P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 <0.001 <0.001

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

目前HE的發(fā)病機制尚未完全明了，關(guān)于發(fā)病機制的主要學說有氨中毒、氧化應激、γ-氨基丁酸、錳離子、假性神經(jīng)遞質(zhì)、血漿氨基酸失衡等[31]。氨中毒是目前主流的認同觀點，在HE治療過程中降低血氨仍是主要的治療措施。在臨床治療過程中緩解氨中毒癥狀可以減緩HE患者的臨床昏迷癥狀。臨床前瞻性研究中血氨與認知功能障礙存在一定的劑量依賴關(guān)系[32]。而且國內(nèi)外關(guān)于氨中毒對HE發(fā)病機制及其神經(jīng)系統(tǒng)病變影響的研究已經(jīng)取得了一定進展，已有研究[33]表明在大鼠慢性HE模型中，降低血氨后大鼠神經(jīng)系統(tǒng)一系列測試和評分都有改善，降低血氨對大鼠肝功能生物標志物及一些炎癥因子、凋亡基因、神經(jīng)遞質(zhì)的表達都有一定影響。與此相似的是，本研究中慢性HE大鼠血氨的升高可能對Sema3A/NRP-1的表達也有一定的影響作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Sema3A及其受體NRP-1在大鼠HE后隨著病變的進展表達逐漸上調(diào)，Sema3A/NRP-1可能參與到抑制軸突生長，阻礙神經(jīng)介導，擾亂神經(jīng)功能的病理生理機制中。血氨、Alb等炎性介質(zhì)也可能對Sema3A/NRP-1的表達及其他基因調(diào)控機制有一定的影響。基于當前的研究進展，可對Sema3A/NRP-1神經(jīng)軸進行NRP-1抑制肽、基因調(diào)控、尋找上下游靶點等進行干預。本研究尚未進行干預措施的研究，但為其相關(guān)干預的研究提供了靶點及良好的理論基礎(chǔ)。