單慧毓，張冬梅，盧 靖，王 健

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

腦出血是臨床上常見的腦血管疾病，具體是指顱內血管破裂出血并在腦實質內形成血腫，其對神經功能造成的損害是十分嚴重的。腦出血發(fā)病時間短、進展較快、病情危重，病死率高，且腦出血的病理過程比較復雜[1]。在腦出血病理過程中，神經細胞的凋亡對人體的損害最為嚴重，而其中的內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS） 通路是目前學者們研究的熱點，ERS 通路參與了腦出血后神經細胞凋亡的病理過程。近年來，不斷有學者證明，破血化瘀法對腦出血疾病的治療起到了良性調節(jié)的作用，其代表方抵當湯治療效果顯著。劉軍瑩等[2]經過大量的臨床數據整理分析，認為在治療急性腦出血中，抵當湯加味聯合西藥組，其臨床效果優(yōu)于單純應用西藥組，這種方法應積極應用于臨床腦出血的診治。本文研究觀察抵當湯對大鼠腦出血后eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白表達的影響，探討抵當湯是否通過干預內質網應激通路而減輕細胞凋亡，從而發(fā)揮神經保護作用，為抵當湯治療腦出血提供實驗依據，進而為治療腦出血后神經細胞凋亡引起的神經損傷尋求潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 研究對象為60 只健康的Wistar 大鼠，質量240～300 g，平均為263.5 g，購買于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。抵當湯新綠色顆粒劑（生大黃5 g，水蛭5 g，桃仁15 g，虻蟲5 g），使1 mL藥液中含生藥1 g（四川新綠色顆粒藥業(yè)科技發(fā)展有限公司），采用傳統煎藥法，水煎液濃縮，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩４笫竽X立體定位儀；手持式牙科鉆；電熱鼓風干燥箱；酶標儀；臺式高速離心機；電子天平；微量進樣器；電泳儀；轉膜儀；勻漿器；一抗；二抗；緩沖液；裂解液；顯色液等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及給藥 參照徐氏等[3]方法造模。首先進行麻醉，向腹腔注射現配的10%的水合氯醛（350 mg/kg）。將大鼠俯臥位固定在立體定位儀上并進行調節(jié)，將大鼠門齒固定于門齒鉤上，使前、后囟基本在同一水平面上。消毒器具及大鼠頭部皮毛，沿正中線切開頭部皮膚，暴露冠狀縫及前后囟門。按照大鼠腦立體定位圖譜，設定前囟為 0 點，在0 點前0.4 mm，中線旁開3 mm 處做標記，用牙科鉆鉆開一個直徑約為1 mm 的小孔，達到硬腦膜表面，注意不要傷及硬腦膜及周圍腦組織。用事先準備好的40 ℃溫水仔細清洗大鼠尾部，并加熱，觀察鼠尾，待鼠尾充血后，用75%的乙醇消毒。提取尾動脈，用微量注射器取50 μL 的不抗凝動脈血，將動脈血注入尾狀核。傷口進行消毒縫合，均勻涂抹青霉素粉末以防止術后感染。假手術組操作過程同上，但不向尾狀核注入自體血，最后，將大鼠尾部用無菌紗布進行包扎、止血。術后人工排尿，清理會陰。正常對照組：自由飲食飲水。假手術組、模型組：生理鹽水灌胃，1 mL/100 g，每天1 次；抵當湯低、中、高劑量組：0.13、0.26、0.52 mL/100 g 湯藥灌胃，每天1 次。以上大鼠均在麻醉清醒后（約術后3 h）給藥，直到喂藥到時間點宰殺，離斷頭顱，開顱，分離海馬，取患側大腦皮層。

1.2.2 大鼠神經功能評分 等待大鼠清醒后，進行行為學分析，采用Longa 評分法[4]進行評價，0 分：大鼠無神經系統功能缺損癥狀；1 分：左前側肢體不能完全伸直；2 分：在大鼠行走時，出現轉圈的行為；3 分：在大鼠行走過程中，出現向患側肢體的傾倒現象；4 分：不能自發(fā)獨立行走，大鼠出現意識喪失的現象。

1.2.3 Western Blot 法檢測eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 的表達。

1.3 統計學分析 采用Graphpad Prism 5 軟件進行統計學分析。采用t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析，以Tukey’s multiple Comparison Test 進行組間比較。

2 結果

2.1 大鼠神經功能評定

2.1.1 一般狀態(tài) 與假手術組大鼠比較，模型組大鼠進食量明顯減少，身體消瘦，一般狀態(tài)較差，毛色暗淡、無光。與模型組大鼠比較，抵當湯低、中、高組大鼠在給藥3 d 后上述癥狀明顯改善。

2.1.2 神經系統體征及神經功能缺損評分 假手術組大鼠未見神經功能缺損的體征，與假手術組大鼠比較，模型組大鼠出現明顯的神經系統病理體征，出現偏側肢體癱瘓，以前肢為重，行走時呈順時針追尾狀。與模型組大鼠比較，抵當湯各組大鼠在給藥3 d 后上述癥狀明顯改善，到第7 天基本恢復正常，差異有統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分（）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001

2.2 腦含水量測定 與假手術組大鼠比較，在損傷腦組織3 d 后，模型組大鼠腦區(qū)含水量明顯增加（P＜0.01）。在給藥第3 天后抵當湯低、中、高級量組與模型組大鼠比較腦區(qū)含水量明顯降低，差異有統計學意義，見表2。

表2 各組大鼠腦水腫含水量比較（）

表2 各組大鼠腦水腫含水量比較（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與假手術組比較，△△P ＜0.01

2.3 各組大鼠eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組的P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達量升高（P＜0.01）；與模型組比較，抵當湯組P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達量降低，有顯著性差異。見圖1～圖3。

3 討論

圖1 各組大鼠腦組織eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 免疫蛋白印跡（western blot）

圖2 各組大鼠腦組織CHOP 免疫蛋白表達

圖3 各組大鼠腦組織P-eIF2 α 免疫蛋白表達

內質網是一種膜性細胞器，主要與真核細胞中蛋白質合成、折疊與分泌有關。大約有30%的細胞蛋白質在內質網中經過折疊、加工和修飾，形成有活性的功能性蛋白質，如絕大多數分泌蛋白、整合膜蛋白及膜結合蛋白[5-7]。當細胞出現缺血再灌注中損傷、氧化應激損傷、鈣離子代謝紊亂及沉積、細胞能量的水平下降、異常的糖基化反應等各種生理和病理因素時，便會產生應激反應，我們稱之為內質網應激損傷，這也是近年來分子生物學領域研究熱點之一[8]。ER 應激是炎性疾病的主要原因[9]。ICH 后有原發(fā)性和繼發(fā)性的腦損傷，損傷導致細胞代謝受到損壞并且激活一系列應激反應，如內質網應激中的 UPR[10]。一些報道表明，氧化應激[11]，鈣離子超載[12]，離子紊亂[13]和毒性物質的釋放[14]可能在各種疾病中誘發(fā)內質網應激，進而引發(fā)細胞凋亡。內質網會激活 PERK-eIF2α 信號通路，導致蛋白質合成的持續(xù)減少，進而導致神經細胞凋亡和一些常見的臨床疾病[15-16]。在卒中模型中，PERK-eIF2α 蛋白的表達亦顯增高的趨勢[17]。CHOP 是一種細胞應激的相關蛋白，也是ERS 過程中重要的中間信號分子[18]，當內質網應激的時間過長或者強度過度過高時，ERS 會激活CHOP 信號通路，引起細胞凋亡。有研究者發(fā)現CHOP 是內質網應激損傷的直接靶點，CHOP 在NMDA 誘導的損傷的β 細胞中表達增加[19]。近年來，中醫(yī)藥學者經不斷實驗研究，體外實驗證明了抵當湯可通過阻斷IRE1 和PERK 信號通路，降低腦出血誘導的內質網應激[20]。另有研究表明，在腦出血急性期，化瘀類中藥可以通過促進半暗帶腦水腫的吸收而減輕腦水腫，從而減輕細胞凋亡和促進血管內皮的新生，在腦出血病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮保護作用[21]。一些學者發(fā)現白藜蘆醇對早期腦損傷有治療作用，它可以通過減輕內質網應激從而發(fā)揮對神經系統的保護作用[22]。

本實驗結果表明，抵當湯可以通過下調eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白的表達，抑制與細胞凋亡相關的信號通路的活化，從而抑制過度的內質網應激損傷，對腦出血半暗帶區(qū)的神經細胞有保護作用，從而減輕凋亡。