李慶杰，王若汗，馮佳亮，張 行，王法宇，連樹林*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021；2.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春 130012；3.北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)中藥系，北京 100079）

胡桃楸是民間習(xí)用傳統(tǒng)中藥，含有醌類及苷、黃酮類、鞣質(zhì)類及三萜類等化學(xué)物質(zhì)，并具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗氧化、抗菌和鎮(zhèn)痛等作用[1]。其中胡桃醌是胡桃楸的重要活性物質(zhì)，胡桃醌屬于萘醌類化合物，萘醌類藥物很早就應(yīng)有于癌癥、胃病、心血管疾病等多種疾病的治療[2-3]。WEN 等[4]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡桃醌具有抗癌的作用，可以降低大鼠小腸癌癥的發(fā)病率。左瑞庭等[5]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可通過調(diào)節(jié)Akt 磷酸化來調(diào)控p21 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)A-FLSs 增殖和凋亡過程。本文以小鼠SH-SY5Y 神經(jīng)母細(xì)胞瘤為研究對象，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對胡桃醌干預(yù)后的差異基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在探討胡桃醌抗腫瘤機(jī)制，為胡桃醌抗腫瘤新藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

胡桃醌（由青龍衣中分離純化得到，經(jīng)HPLC 檢測純度達(dá)96%以上）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司）；胰酶（Invitrogen 公司）；Na2HPO4·H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，二甲基亞砜（DMSO）等（北京化工廠，分析純）；CCK8 試劑盒（Sigma 公司）。SHSY5Y 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。INFINITE M200 酶標(biāo)儀（瑞士TECAN），IX71 倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS），MILI Q 超純水器（美國MILLIPORE），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國 THERMO），SW-CJ-1F 超凈臺（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），LD5-2B 離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司），BCD-215TD GA 冰箱（海爾集團(tuán)），BSA224S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，北京），LDZX-30KBS 型蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）高效液相色譜儀LC-20AT（日本島津）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)。每周更換培養(yǎng)基3 次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 胡桃醌樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取胡桃醌樣品10 mg，加入PBS 2 mL，超聲處理（功率100 W，頻率50 KHz）10 min，0.22 μm 濾膜濾過除菌，制成5 mg/mL樣品儲備液，低溫保存，用前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.3 CCK8 法測定細(xì)胞存活率 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細(xì)胞以7×104的濃度接種至96 孔板，每孔100 μL 培養(yǎng)液，37 ℃飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)24 h，空白組加入培養(yǎng)液100 μL，對照組加入HCPT 母液100 μL 樣品孔加入胡桃醌溶液100 μL 使終濃度為1.5、3、6、12.5、25、50、100、200、300、400 μg/mL，每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入CCK8 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀450 nm 測定各孔吸收值A(chǔ)。

細(xì)胞存活率=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

2.4 Westem-blot 方法 SH-SY5Y 細(xì)胞采用Novagen公司的Cytobnster 提取細(xì)胞總蛋白，提取蛋白經(jīng)10%SD S-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜以含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，5 min/次，加入山羊抗兔/鼠的HRP 標(biāo)記二抗，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h；0.1% TBST 洗膜3 次，5 min/次；硝酸纖維素膜以Supersignal WestFem 化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。Actiti 作為內(nèi)參對照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

2.5 RT-PCR 檢測p53 mRNA 表達(dá)水平 按試劑盒說明提取總RNA，RT-PCR 按說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用含0.5 mg/L 溴化乙錠的15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，最后用凝膠成像系統(tǒng)Quan-tity one 軟件分析結(jié)果，p53 與GAPDH 條帶的相對含量比值表示。GAPDH，p53 的引物及擴(kuò)增片段長度見表1。

表1 PCR 引物序列和產(chǎn)物長度

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用Anova 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞活性具有明顯的抑制效果，且呈劑量依賴性，隨著胡桃醌濃度的升高，對細(xì)胞活性的抑制效果增強(qiáng)，濃度在25 μg/mL時細(xì)胞存活率明顯下降，且在胡桃醌濃度達(dá)到200 μg/mL 時，細(xì)胞存活率接近50%，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此選擇25、50、100、200 μg/mL 濃度進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。見表2。

表2 胡桃醌不同濃度（μg/mL）對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響（，n=3） %

表2 胡桃醌不同濃度（μg/mL）對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響（，n=3） %

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)基因及KEGG 通路分析 差異表達(dá)基因的鑒定采用 R with edgeR package；當(dāng)qvalue ＜0.05，定為差異表達(dá)基因。logFC 為差異倍數(shù)的log2 轉(zhuǎn)換值（=1 時表示2 的+1次方，表示該基因在處理vs 對照相比，上調(diào)了2 倍）。通過處理組與對照組分析，共找到821 個顯著性差異的基因。根據(jù)研究目的通過KEGG 注釋，找到p53信號通路。p53 基因是人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa 的蛋白質(zhì)，命名為p53。p53 蛋白由393 個氨基酸組成，具有特異的轉(zhuǎn)錄激活作用。p53 是一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)（protein）是一種轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor），其控制著細(xì)胞周期的啟動。許多有關(guān)細(xì)胞健康的信號向p53 蛋白發(fā)送。關(guān)于是否開始細(xì)胞分裂就由這個蛋白決定。如果這個細(xì)胞受損，又不能得到修復(fù)，則p53 蛋白將參與啟動過程，使這個細(xì)胞在細(xì)胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53 缺陷的細(xì)胞沒有這種控制，甚至在不利條件下繼續(xù)分裂。像所有其他腫瘤抑制因子一樣，p53 基因在正常情況下對細(xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。細(xì)胞中抑制癌變的基因“p53”會判斷DNA 變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細(xì)胞自我修復(fù)，若DNA 變異較大，“p53”就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53 是重要的腫瘤抑制基因。

3.3 p53 信號通路中p53 蛋白表達(dá)情況分析 Western-blot 結(jié)果所示，與對照組相比，SHSY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53 蛋白表達(dá)水平在加入胡桃醌作用后顯著上調(diào)，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關(guān)系，其表達(dá)量隨著胡桃醌濃度的升高而升高，組間差異顯著（P＜0.05）。見圖2，表3。

3.4 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞p53 mRNA 表達(dá)的影響 經(jīng)RT-PCR 方法檢測p53 mRNA 表達(dá)變化，不同濃度胡桃醌誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡后p53 基因mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關(guān)系，其表達(dá)量隨著胡桃醌濃度的升高而升高，組間差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

圖2 p53 基因蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

表3 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞p53 表達(dá)影響（，n =3） %

表3 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞p53 表達(dá)影響（，n =3） %

表4 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞p53 mRNA 表達(dá)影響（，n =3） %

表4 胡桃醌對SH-SY5Y 細(xì)胞p53 mRNA 表達(dá)影響（，n =3） %

4 討論

細(xì)胞凋亡是由多個信號通路調(diào)控的一個程序性細(xì)胞死亡過程[6-7]。在多數(shù)細(xì)胞類型中，p53 是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，p53 基因介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動中起重要作用，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8-9]。腫瘤抑制因子p53 在刺激下可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡，促進(jìn)p53 轉(zhuǎn)錄促凋亡基因，從而引起細(xì)胞凋亡。胡桃醌具有一定的抗腫瘤活性[10-11]，可能與上調(diào)p53mRNA 及p53 的表達(dá)有關(guān)。p53 可以轉(zhuǎn)錄活化許多靶基因，如p21，Bax，Bid，Puma 等，p53 也通過轉(zhuǎn)錄非依賴的形式來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并能夠直接激活Bax，誘導(dǎo)Bax 寡聚[12-13]。胡桃醌可抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖。該研究證明了細(xì)胞中自由基的提升與胡桃醌有關(guān)，并且在胡桃醌誘導(dǎo)下破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)從而引起caspase 活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。另外，p53 能夠?qū)ax 從Bax-Bcl 的復(fù)合物中置換出來。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別應(yīng)用RT-PCR 和Western-blot 方法檢測了p53mRNA及p53 表達(dá)水平，分析結(jié)果顯示，胡桃醌能明顯上調(diào)p53 mRNA 及p53 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-18]。

綜述所述，本研究結(jié)果證實(shí)了胡桃醌導(dǎo)致SHSY5Y 細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平而發(fā)揮的，與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因p53 表達(dá)相關(guān)。