姜海偉 ，笱玉蘭，邵 衛(wèi)，陳國(guó)華*，羅利俊，王俊力,，高 炎

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065；2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430022）

卒中后認(rèn)知障礙是目前卒中診療的研究熱點(diǎn)之一。王永炎院士提出中風(fēng)“毒損腦絡(luò)”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)[1]，同時(shí)認(rèn)為“毒損腦絡(luò)”是卒中后癡呆的重要致病病機(jī)[2]。從卒中發(fā)生到卒中后認(rèn)知障礙出現(xiàn)，“毒”邪的產(chǎn)生一般在中風(fēng)發(fā)生前或發(fā)生時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)，盡早干預(yù)“毒邪”對(duì)防治卒中后認(rèn)知障礙有重要的意義。本研究通過實(shí)驗(yàn)方法，以黃連解毒湯為解毒代表方，采用造模后24 h 和造模后7 d 的不同時(shí)段給藥，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)、大腦皮層Notch 信號(hào)通路的影響，綜合評(píng)價(jià)不同時(shí)段給藥對(duì)大鼠行為學(xué)的影響及作用機(jī)制，進(jìn)而明確早期采用黃連解毒湯干預(yù)能否減少卒中后認(rèn)知障礙的發(fā)生，同時(shí)了解解毒治療的應(yīng)用時(shí)機(jī)問題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 采用SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（250±30）g，購(gòu)買于湖北省宜昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。SYXK（鄂）2017-0067。溫度：21～25 ℃，日溫差：±1 ℃，濕度：50%～70%，普通飼料喂養(yǎng)。蘇木素染液，伊紅染液由谷歌生物提供。EDTA（pH 值8.0）抗原修復(fù)液、G1206、EDTA（pH 值9.0）抗原修復(fù)液、檸檬酸（pH 值6.0）抗原修復(fù)液由Servicebio 提供。Notch1 多克隆抗體、Hes1 多克隆抗體、VEGF 多克隆抗體、Stat3 多克隆抗體由Servicebio 提供。脫水機(jī)、包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司。病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司提供，掌上離心機(jī)由Servicebio提供，成像系統(tǒng)，由日本Nikon 提供。酶標(biāo)檢測(cè)儀，由Rayto 提供。Morris 水迷宮視頻檢測(cè)儀由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)室提供。黃連解毒湯：由黃連、黃芩、黃柏、梔子按 3:2:2:3 比例混合，加10 倍量水，煎煮1 h，共煎3 次。濾液合并，離心后濃縮干燥即得，收率為 20%（含黃芩苷 58.39 mg/g，HPLC 測(cè)定）。其提取物由武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑中心提供,課題組采用 HPLC 法測(cè)定黃連解毒湯提取物中黃芩苷含量的方法作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物造模方法 采用多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型[3]。血栓制備：同種SD 大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈采血，干燥研碎，制成血栓栓子，按1 mg 栓子加0.9%氯化鈉注射液0.3 mL 比例，搖勻制備血栓懸液。造模：取10%水合氯醛腹腔麻醉，頸部正中切開皮膚，分離肌肉筋膜等組織，可看到頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈，取止血夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈，取1 mL注射器吸入血栓懸液，于頸外動(dòng)脈逆行注入血栓懸液0.3 mL，推注同時(shí)謹(jǐn)慎開放頸總動(dòng)脈，使血栓可通過頸內(nèi)動(dòng)脈的血流進(jìn)入顱內(nèi)各動(dòng)脈，從而造成多發(fā)性腦梗死，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈注射口近端及遠(yuǎn)端,縫合皮膚。術(shù)后每鼠肌肉注射青霉素10 萬U，連續(xù)注射4 d。假手術(shù)組于頸部正中切開皮膚后，僅分離出頸總動(dòng)脈后，不結(jié)扎、不剪斷，暴露5 min 直接縫合皮膚。造模成功評(píng)估：使用mNSS評(píng)分表對(duì)大鼠進(jìn)行綜合評(píng)定，內(nèi)容包括肌力、意識(shí)、肌張力、感覺、反射、共濟(jì)運(yùn)動(dòng)。評(píng)分大于2 分以上為造模成功。造模結(jié)果：根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果及存活情況，最后入選情況為：假手術(shù)組11 只，7 d 模型對(duì)照組10只，24 h模型對(duì)照組11只，7 d黃連解毒湯10只，24 h 黃連解毒湯11 只。其中假手術(shù)對(duì)照組不予以處理；24 h 模型對(duì)照組及7 d 模型對(duì)照組，在造模成功后24 h及7 d 給予等量溶劑，0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液 1 mL/（100 g·d），連續(xù)給藥 1 個(gè)月；24 h 及7 d 黃連解毒湯組，在造模成功后24 h 及7 d 予以中劑量黃連解毒湯433 mg/（kg·d）灌胃[4]。

1.5 大鼠腦組織取材 按照實(shí)驗(yàn)安排，給藥 28 d 并完成水迷宮實(shí)驗(yàn)后，從每組動(dòng)物中各隨機(jī)選取4只大鼠，麻醉后將其固定、開胸，將灌注針頭從大鼠心尖部進(jìn)針，經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，緩慢注入肝素化生理鹽水約200 mL，可見右心耳處流出清澈液體，再灌注4%多聚甲醛約250 mL，灌注期間可見大鼠四肢抽搐，暴露的肝臟組織逐漸變硬變白，待抽搐停止時(shí)停止灌注，斷頭后將整塊腦組織翹起，取出后剝離硬腦膜，將腦組織置于4%多聚甲醛固定[5]。其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100 g），于枕骨大孔處用剪刀橫斷，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀，剪開頂骨，用止血鉗分離兩邊頂骨，剪斷視神經(jīng)后用剪刀探到顱底，將整塊腦組織翹起。將腦組織置于冰塊上，于5 min 內(nèi)謹(jǐn)慎分離出大腦皮層組織和海馬組織。分離后于液氮中迅速冷凍，取出后置于-80℃冰箱保存[6]。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)檢測(cè) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]各組大鼠喂藥28 d 后進(jìn)行。Morris 水迷宮主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)：先連續(xù)訓(xùn)練4 d，大鼠在120 s 內(nèi)爬上隱蔽平臺(tái)，并停留3 s 以上，此為逃避潛伏期。如果120 s未能找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)到平臺(tái)，熟悉10 s后撤離大鼠。第5 天，從平臺(tái)所在象限對(duì)角象限作為入水點(diǎn)，作為最后的游泳結(jié)果，電腦軟件可記錄逃避潛伏期時(shí)間和運(yùn)行軌跡?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：同樣在實(shí)驗(yàn)第5 天，撤去水中的隱蔽平臺(tái)，取原平臺(tái)的對(duì)角象限作為入水點(diǎn)，將大鼠放入水中游泳，電腦軟件可觀察并記錄120 s 內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

1.4.2 HE 染色檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu) 隨機(jī)將組織從4%多聚甲醛固定液取出進(jìn)行脫水。將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。冷卻后切片，脫蠟，伊紅染液中染色1～3 min。再進(jìn)行乙醇脫水封片，從二甲苯取出切片晾干，采用中性樹膠封片[8]。顯微鏡下觀察分析。

1.4.3 Western blot 檢測(cè)大鼠皮質(zhì)中 Notch 信號(hào)通道Notch1 和 Hes1 蛋白及Stat3 蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF蛋白含量 大鼠新鮮腦組織取梗死側(cè)大腦皮層，充分裂解，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量并計(jì)算上樣量，行蛋白SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將 Notch1、Hes1 以及Stat3、VEGF、β-actin一抗用抗體稀釋液稀釋后進(jìn)行膜孵育，置于條件為4 ℃的搖床中過夜。第二天用TBST 液洗滌3 次，加入稀釋過生物辣根過氧化酶 H R P 標(biāo)記的二抗，室溫下孵育 2 h，隨后用 ECL 液進(jìn)行顯影，并用Image（美國(guó)BIO-R AD 公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測(cè)定各樣本灰度值[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表 示，各組之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期測(cè)定結(jié)果（） s

表1 各組大鼠逃避潛伏期測(cè)定結(jié)果（） s

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與7 d 模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與7 d 黃連解毒湯比較，▲P ＜0.05；與24 h 模型對(duì)照組比較，□P ＜0.05

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2。

表2 各組大鼠120 s 內(nèi)通過平臺(tái)次數(shù)（）

表2 各組大鼠120 s 內(nèi)通過平臺(tái)次數(shù)（）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與7 d 模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與7 d 黃連解毒湯比較，▲P ＜0.05，與24 h 模型對(duì)照組比較，□P ＜0.05

2.2 各組大鼠HE 染色病理結(jié)果 各模型組皮質(zhì)梗死區(qū)腦細(xì)胞增大，結(jié)構(gòu)欠清，細(xì)胞核偏居一側(cè)，部分神經(jīng)元出現(xiàn)死亡。梗死周圍區(qū)細(xì)胞大小居中，細(xì)胞核居中飽滿，24 h 黃連解毒湯組可見梗死區(qū)細(xì)胞核縮小，存活細(xì)胞密度高，胞漿著色與梗死周圍區(qū)其他模型組相比相對(duì)差異較小，其余各模型組差異不明顯。假手術(shù)組未見明顯梗死區(qū)域及梗死細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組大鼠梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)HE 染色病理結(jié)果

2.3 對(duì)各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF蛋白的影響 7 d 及24 h 模型對(duì)照組大鼠腦組織皮層中 Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）；7 d 及24 h 黃連解毒湯組與假手術(shù)、7 d及24 h 對(duì)照模型組比較，Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。24 h 黃連解毒湯組和7 d 黃連解毒湯組對(duì)比，Hes1 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表達(dá)情況

圖4 各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表達(dá)灰度值對(duì)比分析

3 討論

中醫(yī)絡(luò)病學(xué)將絡(luò)脈分為“氣絡(luò)”和“脈絡(luò)”?！皻饨j(luò)”與“神經(jīng)—免疫—內(nèi)分泌”有關(guān)，“脈絡(luò)”則與微循環(huán)及血管再生相關(guān)。腦絡(luò)是為絡(luò)脈的一部分[11]。一般認(rèn)為，顱腦內(nèi)細(xì)胞及分子信號(hào)通道、神經(jīng)傳導(dǎo)、神經(jīng)突觸連接、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)免疫等均屬腦之“氣絡(luò)”范疇，而腦內(nèi)側(cè)枝循環(huán)、血管再生相關(guān)的因子應(yīng)屬“脈絡(luò)”的范疇。廣義的毒邪則包含虛、氣、血、痰、瘀、風(fēng)等病理因素均參與了“毒”邪產(chǎn)生過程[12]，目前認(rèn)為，西醫(yī)的“缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)”為“毒損腦絡(luò)”病機(jī)提供了一定的現(xiàn)代生物學(xué)的依據(jù)[13]。本研究采用多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型，有研究表明多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型與多發(fā)性腦梗死癡呆模型造模方法相同，多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型大鼠空間辨別能力下降，近期記憶減退，學(xué)習(xí)獲得能力及保持能力均有下降[14]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，中劑量黃連解毒湯即可顯著增強(qiáng)全腦缺血模型小鼠對(duì)新奇物體的分辨能力，并提高小鼠海馬CA1 區(qū)的功能神經(jīng)元細(xì)胞的密度[15]。同時(shí)研究還表明，黃連解毒湯提取物具有抗自由基、提高乙酰膽堿含量、改善腦血流量，對(duì)血管性癡呆具有一定的治療作用[16]。

本研究中我們從“氣絡(luò)”的角度研究了與卒中后認(rèn)知障礙相關(guān) Notch 信號(hào)通道。結(jié)果表明，缺血性卒中可以激活Notch 信號(hào)通道。在體實(shí)驗(yàn)表明，通過抑制Notch 信號(hào)通路，減少缺氧腦組織中TLR4、MyD88、TNF 等因子的表達(dá)，減少NF-kB 的表達(dá)和轉(zhuǎn)位，從而減輕大腦神經(jīng)元的炎性損傷[17]。體外實(shí)驗(yàn)表明，N9 細(xì)胞可表達(dá)Notch 信號(hào)通路受體Notch1，及配體Jagged2、Dll-1、Dll-4 及下游基因Hes1、Hes5，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化。Notch 信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)，有可能因被“記憶”而長(zhǎng)期存在[18]。本研究表明，黃連解毒湯能夠在一定程度上抑制Notch 信號(hào)通路的激活，改善卒中后認(rèn)知功能。24 h 黃連解毒湯組逃避潛伏期及空間檢測(cè)能力明顯優(yōu)于7 d 黃連解毒湯組。說明盡早應(yīng)用“解毒”藥物，盡快抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，對(duì)改善其認(rèn)知功能有重要的意義。同時(shí)，JAK/STAT3 信號(hào)通路同樣是一個(gè)參與缺血再灌注損傷后的關(guān)鍵炎性途徑，與記憶功能有著重要的關(guān)系[19]，一旦發(fā)生腦缺血損傷，JAK2-STAT3信號(hào)通路可被激活，STAT3 活化后促使LTD 增加，導(dǎo)致LTP 和LTD 的平衡發(fā)生失調(diào)，最終導(dǎo)致突觸可塑性下降。實(shí)驗(yàn)表明，通過抑制JAK2 磷酸化，從而阻滯STAT3 活化并阻滯STAT3 的釋放可促使LTD 減少，進(jìn)而使LTP 和LTD 保持動(dòng)態(tài)平衡，改善實(shí)驗(yàn)大鼠的空間記憶損害[20]。該研究表明，黃連解毒湯同樣能抑制STAT3 的活化。

在“脈絡(luò)”方面，我們研究了黃連解毒湯對(duì)于皮層區(qū)梗死周圍腦血管新生方面的作用，VEGF 在血管新生中發(fā)揮著極為重要的作用。VEGF 表達(dá)增加最早在梗死發(fā)生3 h 后即可檢測(cè)到，可一直持續(xù)到3 d 或7 d[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使造模28 d 后，各模型組的VEGF 表達(dá)仍高于假手術(shù)組，但治療組及對(duì)照組與假手術(shù)組間對(duì)比未見顯著性差異。一方面考慮與每組檢測(cè)樣本量偏少有關(guān)，同時(shí)也與梗死后間隔時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞分化尖端細(xì)胞和莖細(xì)胞受 VEGF 和Notch 信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)，VEGF 是血管新生的正反饋調(diào)節(jié)因素，而通過誘導(dǎo)配體Dll4 的表達(dá)而啟動(dòng) Notch信號(hào)通道則作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)因素，可有效預(yù)防過量血管的形成，二者的相互作用，可使血管保持在合理的比例內(nèi)并發(fā)揮其功能[6,22]。由于本研究是基于認(rèn)知障礙而設(shè)計(jì)，其相關(guān)蛋白及信號(hào)通道為治療后28 d 的結(jié)果，尚難以說明梗死早期階段黃連解毒湯對(duì)VEGF 的作用及Notch 信號(hào)通道的影響作用如何，這也為本研究的進(jìn)一步深入提供了方向。

通過本研究我們可以看到早期采用黃連解毒湯可以改善模型大鼠的行為學(xué)，在一定程度上是通過抑制Notch 及STAT3 信號(hào)通路，減少其梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元凋亡來實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果表明，在卒中后盡早使用黃連解毒湯具有預(yù)防卒中后認(rèn)知障礙出現(xiàn)或進(jìn)一步發(fā)展的作用，解毒治療也有其“時(shí)間窗”。