徐文剛，唐永政，張建柏，征矢野清，鄒華鋒

（1.煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺市海洋經濟研究院，山東 煙臺 264003；3.長崎大學中國東海環(huán)境資源研究所，日本 長崎 851-2213；4.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心/水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

【研究意義】硬骨魚類的成熟以及排卵和排精主要受到以下丘腦-垂體-性腺軸為中心的內分泌系統和外界環(huán)境因子的綜合影響［1］。魚類受到光照和水溫等環(huán)境因子的刺激后，在下丘腦合成促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH），GnRH誘導垂體合成促性腺激素（gonadotropins, GtHs），GtHs中的促黃體激素（luteinizing hormone, LH）能誘導生殖細胞合成成熟誘導激素（maturation-inducing hormone,MIH），最終促進排卵和排精［1］。因此，GnRH和GtHs對誘導魚類成熟具有重要作用。但是，由于對誘導對象魚種的GnRH和GtHs的精制較為困難，目前國內外生產上常用人工合成的促黃體激素釋放激素類似物（Luteinzing hormone releasing hormone analog, LHRHa）或人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin,HCG）作為替代品［2-3］?！厩叭搜芯窟M展】國內有報道運用HCG誘導雌性花鰻鱺（Anguilla marmorata）性腺成熟［4］以及注射LHRH對刀鱭（Coilia nasus）催產效果的影響［5］，而有關石斑魚催產和人工繁殖的研究僅在赤點石斑魚（Epinephelus akaara）［6］、鞍帶石斑魚（E.lanceolatus）［7］和蜂巢石斑魚（E.merra）［8］中有少量報道。此外，也有少量與石斑魚的胚胎發(fā)育、生長和疾病相關的研究報道［9-11］。黑邊石斑魚（E.fasciatus）廣泛分布在中國、日本本州中部以南，以及印度洋和太平洋的熱帶和溫帶區(qū)域，是一種最大規(guī)格為50 cm左右的中小型石斑魚類［12］。作為東亞地區(qū)重要的水產資源，其具有很高的市場價值，且被認為高級魚的代表之一。黑邊石斑魚是一種先雌后雄的海水魚類，一般在孵化后80～120日齡時性腺分化為雌性，之后在2～3齡時性腺發(fā)育成熟并排卵，在3～4齡時性逆轉變?yōu)樾坌裕?2］。此前，有關黑邊石斑魚的人工繁殖的技術以及孵化后幼魚的生長在日本東京小笠原水產研究所有少量研究報道［13-14］，為其魚苗的大規(guī)模培育提供了有價值的線索。

【本研究切入點】目前由于黑邊石斑魚的人工繁殖技術在我國尚未完全獲得成功，因此其苗種的獲得主要依靠天然捕撈，而過度捕撈和市場上的巨大需求導致其產量快速下降。雖然國內在石斑魚雜交上的人工繁殖技術已經取得巨大突破，其雜交子二代的養(yǎng)殖產量也逐漸提高［15-16］，但尚未見與黑邊石斑魚人工繁殖相關的報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以在日本長崎市東海海域所捕獲的成熟黑邊石斑魚為研究對象，使用不同劑量的HCG在繁殖季節(jié)對雌魚進行催產和成熟誘導，記錄其成熟后的狀態(tài)。此外，比較不同處理劑量下黑邊石斑魚排卵孵化的效應時間以及雌雄交配后受精率和孵化率的差異，優(yōu)化得出雌魚的最佳HCG催產劑量和效應時間，以期為今后黑邊石斑魚魚苗在國內大規(guī)模的人工繁殖和生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年6—7月在日本長崎市東海海域捕獲到活的黑邊石斑魚約40尾，自然水溫和光照下暫養(yǎng)在5 t 左右的FRP水槽中。5 d后用細長的導管插入魚體卵巢內，采集小部分卵巢組織后，在顯微鏡下確認其卵母細胞的直徑。挑選腹部柔軟膨大，卵巢輪廓明顯，生殖孔紅潤，且卵母細胞直徑為400 μm以上的雌魚作為試驗魚，總數量18尾。雄魚的選取標準為出現婚姻色，輕壓腹部有乳白色精液流出。為了便于今后識別，在雌魚背部肌肉內插入微型電子芯片（FishID SST-1,Destron Fering）進行標記。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 試驗設注射相同劑量生理鹽水的對照處理和200 IU/kg HCG處理、500 IU/kg HCG處理，各處理隨機分配6尾雌魚。HCG激素溶液參照Nambu［17］的方法配制。測量雌魚的體長（total length, TL）和體質量（body weight,BW），計算肥滿度（condition factor, CF）：CF（%）= TL/BW3×100。各處理中魚的體長、體質量和肥滿度均無顯著性差異（表1）。

表1 供試黑邊石斑魚的體長、體質量和肥滿度Table 1 Total length, body weight and condition factor of E.fasciatus in the experiment

1.2.2 人工催產 7月29日至8月1日，使用1 mL注射器，將HCG注入魚體側背部肌肉處后觀察試驗魚排卵的變化。注射后，在效應時間內，觀察到200 IU/kg HCG處理中的個體出現排卵現象，故停止注射試驗；由于沒有觀察到500 IU/kg HCG處理出現排卵現象，在 8月11—17日，繼續(xù)對其進行第二次注射試驗。對照處理均在同一時間進行注射。

1.2.3 卵母細胞的采樣和組織學觀察 在注射前、注射時和注射后的各時段，使用卵細胞抽取器在試驗魚的泄殖孔提取少量卵細胞用于檢測該時段卵母細胞的發(fā)育情況。采集后立即置于波恩試劑中固定24 h后于70%的乙醇中保存用于組織學分析。組織學分析步驟參照Shein等［18］的方法，性腺分期和描述如下：

（1）第三次卵黃球前期（Tertiary yolk1,Ty1）：細胞質中已積累大量卵黃，細胞核周圍有油球開始聚集，但核移動還未開始。

（2）第三次卵黃球后期（Tertiary yolk2,Ty2）：細胞質中已積累大量卵黃，細胞核周圍有大量油球聚集，核移動即將開始。

（3）核移動期（Migratory nucleolus, Mn）：細胞核移動到動物極一側。

（4）成熟期（Mature, M）：細胞核破裂，卵黃球和油球融合且分散在細胞質中。

（5）完熟期（Ripe, R）：卵母細胞通過吸水達到透明化的狀態(tài)。

（6）濾泡閉鎖卵母細胞（Atrefic follicle oocyte, Af）：又稱退行卵母細胞，濾泡細胞與未發(fā)育的卵母細胞結合形成閉鎖卵泡，并對卵母細胞的殘體和碎片進行吞噬和消化。

1.2.4 魚成熟度的確認 排卵前，在魚的卵巢內插入一根細長的導管，采集部分卵巢組織，在顯微鏡下測量其中15～30粒卵母細胞的直徑，直徑大于500 μm即可視為其已經完熟并具備排卵的條件。200 IU/kg HCG處理插入導管的時間為注射前24 h，HCG注射時以及注射后30、36、42、48、54、60 h。500 IU/kg HCG處理插入導管的時間除了與前述處理一致外，須在第二次注射后30、36、42、48、54、60、66 h后再次對成熟度進行確認。

1.2.5 人工授精以及受精率和孵化率的計算 對具備排卵條件的個體，擠壓腹部采集卵子；對成熟的雄性，擠壓腹部采集精子，并采用婁忠玉等［19］的干導法進行人工授精。人工授精后，用海水清洗受精卵，放置在1 L量筒中。靜置后分為上浮卵和下沉卵，將上浮卵回收在500 mL的容器中，并將容器放置在維持自然水溫的水槽中。人工授精后2.5 h取100粒受精卵轉移到培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察細胞分裂的情況，計算受精率。此外，根據受精后24 h孵化的魚苗數量以及死亡卵數，計算孵化率。

1.3 數據處理

利用SPSS 22.0軟件對數據進行比較分析。采用Kolmogorov-Smirnov或 Shapiro-Wilk法進行正態(tài)分布檢測，利用ANOVA檢驗以及 Tukey’s HSD 法進行差異性比較分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理注射HCG前后卵母細胞發(fā)育階段的變化

2.1.1 對照處理與200 IU/kg HCG處理的比較 對黑邊石斑魚性腺進行組織學切片和染色，其各發(fā)育階段分期如圖1所示。根據圖1判定對照處理和200 IU/kg HCG處理注射前24 h、注射時和注射后30、36、42、48、54、60 h卵母細胞的發(fā)育階段，如表2所示。對照處理中，注射前6尾魚卵母細胞均處于Ty1階段，注射后60 h 4尾魚卵母細胞處于Ty1階段，2尾魚處于Ty2階段。200 IU/kg HCG處理中，注射HCG 24 h前，6尾魚中有5尾魚為Ty1階段；注射HCG時，5尾魚為Ty2階段；注射HCG 30、36、42和54 h后1尾魚觀察到核移動卵母細胞（Mn），2尾魚為Ty2階段；但注射48 h后2尾魚出現Mn階段，1尾魚為Ty2階段；注射60 h后1尾魚出現排卵現象，其余5尾魚均為Ty2階段。

2.2.2 對照處理與500 IU/kg HCG處理的比較 根據圖1判定，對照處理和500 IU/kg HCG處理注射前 24 h、第一次注射 0、30、36、42、48、54 h后以及第二次注射 0、30、36、42、48、54、60、66 h卵母細胞的發(fā)育情況，如表3所示。對照處理在第二次注射后66 h，3尾魚卵母細胞處于Ty1階段，3尾魚處于Ty2階段。500 IU/kg HCG 處理中注射HCG 24 h前，6尾魚中只有2尾魚卵母細胞為Ty1階段。此外，雖然注射HCG 48—54 h后，所有檢測到的尾魚均為Ty2階段，但并未觀察到成熟的卵母細胞，因此繼續(xù)進行第二次注射試驗。第二次注射后42—60 h，檢測到1尾魚出現Mn階段；注射后66 h，所有個體均無法排卵且觀察到了退行的卵母細胞（Af）。

圖1 不同發(fā)育階段雌性黑邊石斑魚性腺的切片Fig.1 Histological sections of female E.fasciatus at different gonadal development stages

表2 對照處理和200 IU/kg HCG處理前后黑邊石斑魚卵母細胞發(fā)育階段的變化Table 2 Changes of E.Fasciatus in the oocyte development stage under control and 200 IU/kg HCG treatments

2.2 不同處理注射HCG后卵母細胞直徑的變化

比較200 IU/kg HCG處理和500 IU/kg HCG處理中6尾魚HCG注射時和注射60 h后卵母細胞直徑的變化。HCG注射時，200 IU/kg HCG處理的4號個體卵母細胞直徑僅為477.0 μm，注射60 h后其為排卵階段，卵母細胞直徑增加至624.4 μm；500 IU/kg HCG處理的個體卵母細胞直徑無較大差異（表4）。

表3 對照處理和500 IU/kg HCG處理前后黑邊石斑魚卵母細胞發(fā)育階段的變化Table 3 Changes of E.Fasciatus in the oocyte development stage under control and 500 IU/kg HCG treatments

表4 200 IU/kg 和500 IU/kg HCG處理注射時和注射60 h后黑邊石斑魚卵母細胞直徑的變化Table 4 Changes of oocyte diameter of E.Fasciatus during and after 60 h of HCG injection under 200 IU/kg and 500 IU/kg treatments

2.3 不同處理注射HCG后受精率和孵化率的差異

200 IU/kg HCG處理獲得的總卵數為16 906粒，受精率為68.7%，孵化率為43%；500 IU/kg HCG處理因未觀察到排卵現象而無法統計受精率和孵化率。

3 討論

3.1 誘導時間對排卵的影響

本研究中，對照處理的黑邊石斑魚始終無法成熟，一直停留在第三次卵黃球發(fā)育（Ty）階段，但200 IU/kg HCG處理的卵母細胞在注射前處于Ty階段，注射48 h后卵巢已發(fā)育至核移動期并成熟，60 h后確認排卵。此外，該處理人工受精率為68.7%，孵化率為43%，表明劑量為200 IU/kg的外源HCG 激素可以誘導黑邊石斑魚成熟并排卵。褐石斑魚（E.bruneus）中，注射HCG 48 h后能夠誘導排卵，受精率約為90%，孵化率為60% ～ 80%［20］。七帶石斑魚（E.septemfasciatus）中，注射HCG 42 h后確認排卵，受精率為70% ～ 98%，孵化率為70% ～100%［21］。與上述HCG誘導的時間相比，本研究的誘導時間60 h顯得稍長，表明即使同為石斑魚魚種，其注射HCG激素后生殖生理變化和反應速度也會有很大不同，從而導致排卵誘導時間的差異。此外，與其他石斑魚相比，本研究供試黑邊石斑魚的受精率和孵化率均較低，并且在成熟階段出現了很多退行卵母細胞。因此在今后的研究中，需要再次調整從成熟到排卵的效應時間。

3.2 退行卵形成的主要原因

本試驗中，雖然使用HCG誘導促進了部分個體卵母細胞的成熟，但在很多個體的卵巢內出現了退行卵，其形成的可能原因有以下方面：首先，在檢測魚的卵母細胞發(fā)育程度時，多次使用導管對魚的卵巢進行取樣。對七帶石斑魚的研究表明，這些行為可能對魚產生物理性的影響，導致其壓力負荷大，發(fā)育成熟遲緩和退行［22］，這也可能是導致黑邊石斑魚退行卵形成的原因之一。此外，本研究中的試驗魚是在東海捕獲的天然魚，而不是人工長期飼養(yǎng)的親魚，因此其生理和營養(yǎng)狀態(tài)也存在差異。研究表明，鳳尾魚（Engraulis mordax）處于饑餓下會引起卵巢卵的再吸收而導致其退化［23］。本試驗中，采取無投食飼養(yǎng)的方法，可能是導致黑邊石斑魚退行卵形成的另一原因。研究表明，黑邊石斑魚從卵黃蓄積到成熟產卵的時間在6—7月，青銅石斑魚（E.aeneus）在4—7月［24］，赤點石斑魚在4—6月［25］，七帶石斑魚在 3—5月［18］，褐石斑魚在3—5月［26］。這些數據表明，其他石斑魚從卵黃蓄積到產卵的時間大概持續(xù)2個月左右，但黑邊石斑魚僅持續(xù)1個月，可能由于其成熟適應期的時間太短而導致其成熟比例降低。此外，6—7月為高水溫時期，高水溫抑制成熟，因此卵黃蓄積后到成熟產卵的狀態(tài)難以得到長期維持，也可能導致其無法正常排卵。

4 結論

本研究200 IU/kg HCG處理的6尾黑邊石斑魚在注射HCG 60 h后，最終雖然只有1尾魚成熟且排卵、受精和孵化，其結果可能具有偶然性。但本研究提供了以下可能性：在今后黑邊石斑魚人工繁殖和孵化的過程中，使用劑量為200 IU/kg外源HCG激素可能誘導其成熟且排卵；但為了提高排卵率、受精率和孵化率，其注射劑量和效應時間還需要進一步調節(jié)。此外，為了避免退行卵的形成，應該注意防止水溫過高以及頻繁使用導管對魚的卵巢進行破壞性取樣。目前，黑邊石斑魚人工繁殖技術的突破在國內仍是一大難題，因此，在今后人工繁殖過程中應綜合考慮以上因素。