劉學(xué)輝，李 淳，陳小均，何海永，王莉爽

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006）

【研究意義】目前，貴州把發(fā)展“三白”（即白菜、白蘿卜、蓮花白）作為脫貧攻堅(jiān)的關(guān)鍵舉措；而且蔬菜產(chǎn)業(yè)是貴州省委省政府確定大力發(fā)展的12大特色生態(tài)產(chǎn)業(yè)之一，因此，甘藍(lán)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要。近年來(lái)，對(duì)貴州甘藍(lán)主產(chǎn)地區(qū)的病毒病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是僅次于黃瓜花葉病毒的最重要的田間蔬菜病毒。受TuMV侵染的甘藍(lán)植株表現(xiàn)出花葉、褪綠、葉片扭曲、斑駁等典型癥狀，嚴(yán)重影響甘藍(lán)的品質(zhì)和產(chǎn)量。TuMV是世界上最重要的植物病毒之一，能侵染43科156屬318種植物，包括許多重要的大田作物［1］。TuMV可由至少89種蚜蟲(chóng)以非持續(xù)的方式傳播［1］，因此，TuMV的傳播蔓延速度快，難以防控。而了解TuMV 在不同地區(qū)的發(fā)生分布和遺傳變異是制定相應(yīng)TuMV防控措施的科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】TuMV屬于馬鈴薯Y病毒屬，是一個(gè)正義單鏈RNA病毒，具有長(zhǎng)700～750 nm的彎曲絲狀顆粒，基因組約為10 000個(gè)核苷酸（nt）?；蚪M包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（ORF），它被翻譯成一個(gè)大的多蛋白（自動(dòng)催化水解成10種蛋白質(zhì)），以及一個(gè)小的重疊ORF［2］。TuMV的CP基因是馬鈴薯Y病毒基因組的一個(gè)可變區(qū)，已被廣泛應(yīng)用于該屬分離株的分類［3-5］。從世界各地收集的不同TuMV分離株的基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究表明，TuMV分離株可分為6個(gè)主要的TuMV系統(tǒng)發(fā)育類群：Orchis、basal-Brassica（basal-B）、Iranian、basal-Brassica/Raphanus（basal-BR），Asian-Brassica/Raphanus（Asian-BR）和 world- Brassica（world-B）［6-8］。TuMV分離株在生物學(xué)上可分為5種寄主侵染類型：侵染十字花科植物，但不侵染其他蕓薹屬植物；侵染寄主是潛在的，偶爾侵染蕓苔屬植物，不侵染蘿卜屬植物；系統(tǒng)地侵染大多數(shù)蕓苔屬植物（系統(tǒng)性花葉癥狀），但不侵染蘿卜屬植物；Basal-B（R）寄主侵染多種蕓苔屬植物，表現(xiàn)為花葉癥狀，但偶爾侵染蘿卜屬植物；Asian-BR寄主侵染蕓苔屬和蘿卜屬植物，表現(xiàn)為花葉癥狀［6］。basal-B是變異最大的組群，world-B是變化更大、分布更廣的組群，basal-BR和Asian-BR的變異較小。大多數(shù)歐洲分離株不感染蘿卜，而亞洲分離株同時(shí)感染蕓苔和蘿卜［9］。2002年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)了Asian-BR和world-B組TuMV分離物，隨后又發(fā)現(xiàn)了basal-BR組TuMV分離物［10-11］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】TuMV在我國(guó)浙江、四川、重慶、山東、河北和北京等地的大白菜、蘿卜、甘藍(lán)、辣椒及中藥材如太子參等作物上發(fā)生危害［12-15］，對(duì)作物品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。由于TuMV寄主范圍廣泛，推測(cè)可能與TuMV極易發(fā)生基因重組變異相關(guān)。目前，已有TuMV全基因組、CP基因、Hc-Pro基因、P3基因以及3’-UTR區(qū)段等核苷酸序列的分子變異報(bào)道［16-21］。研究TuMV的遺傳和分子變異，有助于了解病毒生物學(xué)的重要特征，如毒力變化、宿主適應(yīng)性、地理范圍，以及它們作為新的流行病出現(xiàn)的可能性，這對(duì)于提出TuMV的防控措施至關(guān)重要。根據(jù)前期調(diào)查研究，TuMV是危害貴州甘藍(lán)的主要病毒之一，但是對(duì)其病毒分子變異特性等尚未有研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)貴州甘藍(lán)主產(chǎn)地區(qū)的甘藍(lán)病毒病樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，明確TuMV在甘藍(lán)上的發(fā)生分布，用RT-PCR對(duì)甘藍(lán)TuMV分離物的CP序列進(jìn)行擴(kuò)增，并用相關(guān)軟件對(duì)CP序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期為甘藍(lán)抗TuMV的育種和防控提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品：采自貴州省安順市西秀區(qū)、平壩區(qū)，威寧縣草海鎮(zhèn)、雙龍鎮(zhèn)和修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)、久長(zhǎng)鎮(zhèn)等地花葉、黃化等疑似病毒病的甘藍(lán)樣品。每個(gè)區(qū)鎮(zhèn)采集3塊地，每塊地按東西南北中5個(gè)點(diǎn)選取不同癥狀感染病毒病的甘藍(lán)葉片。帶回實(shí)驗(yàn)室后液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：蕪菁花葉病毒（TuMV）多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記物、陽(yáng)（陰）性質(zhì)控物等試劑為美國(guó)阿格迪Agdia公司產(chǎn)品。植物總RNA提取試劑盒 TransZol Up Plus RNA Kit（ER501）、TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02）、EasyTaq?Mix buffer和EasyPure Quick Gel Extraction Kit（EG101）等生物試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蕪菁花葉病毒（TuMV）的血清學(xué)檢測(cè) 稱取0.5～1 g樣品放入樣品提取網(wǎng)眼袋，加入2 mL GEB通用樣品提取緩沖液進(jìn)行研磨。在酶標(biāo)板加入包被抗體100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜（或37 ℃放置3 h），PBST洗板4次，每次浸泡3 min。加入病葉粗汁液100 μL/孔，并設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，37 ℃放置3 h。PBST洗板4次，每次浸泡5 min，然后加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉30 min。加單克隆抗體 100 μL/孔，37℃放置 3 h。PBST洗板后加入羊抗鼠酶標(biāo)抗體100 μL/孔，37 ℃放置3 h，PBST洗板。加對(duì)PNP substrate室溫顯色15～30 min。反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在405 nm波長(zhǎng)處OD值，每份樣品重復(fù)3次，以樣品OD值比陰性對(duì)照OD405值≥2判為陽(yáng)性。

1.2.2 TuMVCP基因的擴(kuò)增，克隆和測(cè)序 植物總RNA提取試劑盒提取甘藍(lán)葉片總RNA。以總RNA為模板，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物設(shè)計(jì)用已報(bào)道的TuMVCP基因序列（GU167976）為參考。引物序列為TuMV CP-F: GCAGATGAAA C G C T T G A C G C A G G C C；T u M V C P-R:TACAACTTCATAACCCCTGAACGCC。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：2 μL cDNA，正向引物、反向引物各 1 μL，12 μL 2×EasyTaq?，9 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，將目的片段進(jìn)行膠回收，用pEASY1–Blunt Simple Cloning Kit進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到DH5a，涂布于載體相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基平板上。陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出后，挑取單菌落進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒，送重慶擎科生物公司測(cè)序。

1.2.3 TuMVCP基因序列分析 測(cè)序序列用NCBI中 BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 進(jìn)行比對(duì)，利用Bioedit5對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，DNAMAN6.0軟件對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸一致性分析；MEGA7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，各分支置信度（bootstrap）進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。以山藥花葉病毒（JYMV）基因組的同源區(qū)作為分析的外群，由于BLAST搜索顯示，它是國(guó)際序列數(shù)據(jù)庫(kù)中與TuMV最為密切相關(guān)的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 TuMV 感染甘藍(lán)的田間癥狀

甘藍(lán)葉片感染病毒以后，葉片出現(xiàn)花葉、黃化、畸形或斑駁，甘藍(lán)生長(zhǎng)緩慢，比健康植株矮?。▓D1）。

圖1 甘藍(lán)感染TuMV的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of cabbage infected with TuMV

2.2 TuMV血清學(xué)檢測(cè)

貴州威寧縣、修文縣和安順市3個(gè)甘藍(lán)主要種植區(qū)采集甘藍(lán)病毒病樣品152份，檢測(cè)出TuMV陽(yáng)性樣品66份，檢出率為43.42%。結(jié)果（表1）表明，TuMV在貴州甘藍(lán)上普遍發(fā)生，而且不同地區(qū)發(fā)生分布存在差異。威寧縣草海鎮(zhèn)、雙龍鎮(zhèn)，修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)、久長(zhǎng)鎮(zhèn)和安順市平壩區(qū)甘藍(lán)感染TuMV的檢出率分別為46.88%、52.38%、58.33%、50.00%和61.54%，安順市西秀區(qū)的甘藍(lán)病毒病樣品上未檢出TuMV。

表1 貴州省甘藍(lán)病毒病樣品TuMV檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of TuMV samples of cabbage from Guizhou Province

2.3 TuMV CP基因的擴(kuò)增

將所有的甘藍(lán)病毒病樣品用TuMV特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得目的片段進(jìn)行回收、連接和轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)序獲得864bp的TuMVCP基因。結(jié)果（圖2）表明，威寧縣草海鎮(zhèn)、雙龍鎮(zhèn)，修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)、久長(zhǎng)鎮(zhèn)和安順市平壩區(qū)甘藍(lán)上感染了TuMV，而安順市西秀區(qū)未檢出TuMV。

圖2 TuMV CP基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 RT-PCR amplification of TuMV CP genes

2.4 TuMV CP基因一致性分析

檢測(cè)出TuMV的每個(gè)地區(qū)選擇3個(gè)分離物進(jìn)行CP基因核苷酸和氨基酸的比較，結(jié)果（表2）表明，15個(gè)分離物間的核苷酸同源性為88.70%～100%，與比對(duì)分離物的同源性要高，而組內(nèi)和組間的氨基酸一致性均為100%。重組分析結(jié)果可知：15個(gè)TuMV分離物CP基因中僅檢測(cè)到1個(gè)潛在事件，即wening-4可能為xiuwen-3和其他序列重組而成。RDP method、GENECONV、Bootscanning、MaxChi、Cimaera、3SEQ和SiScan 7種計(jì)算方法中只有MaxChi算出重組，為8.300×10-4，表明貴州侵染甘藍(lán)的15個(gè)TuMV分離物CP基因無(wú)明顯重組事件。

2.5 TuMV CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，根據(jù)TuMV CP基因核苷酸序列的差異，15個(gè)分離物TuMV基因聚在兩個(gè)不同的分支，Pingba-3與world-B分離物聚為一支，weining-1、2、3、4、5、6，xiuwei-1、2、3、4、5、6，pingba-1、2等14個(gè)分離物與basal-BR聚為一支（圖3）。貴州甘藍(lán)TuMV分離物沒(méi)有分布在Orchis、basal-B、Iranian和Asian- BR組。結(jié)果表明威寧和修文TuMV分離物只有1個(gè)株系，而平壩TuMV分離物有2個(gè)株系。綜上所述，15個(gè)TuMV甘藍(lán)分離物存在2個(gè)株系，basal-BR是為害貴州甘藍(lán)的優(yōu)勢(shì)株系。

3 討論

目前，我國(guó)蘿卜TuMV分離株可分為Asian-BR, basal-BR 和 world-B3個(gè)類群，其中半數(shù)以上（52.54%）為basal-BR類群［22］。隨著對(duì)TuMV重組特性和病毒進(jìn)化的研究，我國(guó)不同省份間優(yōu)勢(shì)株系存在差異。四川分離株聚在world-B群中［5］，山東、吉林兩省蘿卜的TuMV分離株屬于basal-BR［23］。山東、河南、遼寧、黑龍江及陜西等省份具有TuMV大白菜、蘿卜分離物大致歸屬于world-B和basal -BR2個(gè)組［12］； 重慶蘿卜TuMV分離物屬于word-B組和basal-BR組［13］。陜西省32個(gè)油菜TuMV分離物與已知的138株來(lái)自世界其他地區(qū)TuMV分離株或序列進(jìn)行遺傳分類，獲得了4個(gè)遺傳簇：MB（主要是蕓苔屬分離株）、MR（主要是蘿卜屬分離株）、IBR（主要介于蕓苔屬和蘿卜屬簇之間）和OBR（主要是蕓苔屬和蘿卜屬簇之外）［1］。綜上所述，在我國(guó)對(duì)感染TuMV十字花科作物的研究，多數(shù)集中在蘿卜、白菜和油菜，而對(duì)侵染甘藍(lán)的TuMV的株系研究報(bào)道較少。

表2 甘藍(lán)病毒病樣品TuMV CP基因核苷酸同源性分析Table 2 Nucleotide homology analysis of TuMV CP genes in cabbage virus samples

圖3 TuMV CP基因分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of TuMV CP gene isolates

本研究采用ELISA和RT-PCR方法對(duì)貴州甘藍(lán)病毒病樣品進(jìn)行TuMV鑒定，結(jié)果表明兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出結(jié)果一致，說(shuō)明這兩種方法均能保證TuMV檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在貴州威寧、安順和修文等地種植的甘藍(lán)上均能檢測(cè)出TuMV，表明該病毒在貴州的發(fā)生分布較廣。

TuMVCP基因是該病毒分組的重要依據(jù)［24］，而侵染貴州甘藍(lán)的TuMV的種群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)TuMVCP基因進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序比對(duì)，然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)貴州15個(gè)TuMV甘藍(lán)分離物分布在basal-BR和 World-B組中，而北京感染TuMV甘藍(lán)分離物用P3基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，TuMV分離物屬于 World-B組［25］；表明貴州與北京甘藍(lán)TuMV分離物的歸屬是一致的。許多文獻(xiàn)報(bào)道重組在植物RNA和DNA病毒變異和適應(yīng)性進(jìn)化中起著重要作用。在馬鈴薯Y病毒中，74%的TuMV基因組是重組體［10］。貴州15個(gè)TuMV甘藍(lán)分離物CP基因無(wú)重組事件，這與前人研究結(jié)果一致［12］。這可能與寄主植物、采樣時(shí)間、地理分布或環(huán)境條件等因素密切相關(guān)。

貴州甘藍(lán)TuMV是basal-BR為優(yōu)勢(shì)毒源，山東和吉林蘿卜TuMV是basal-BR型，而world-B組為重慶市蘿卜的優(yōu)勢(shì)毒源［23］，這可能由于寄主植物和地理位置不同而產(chǎn)生的差異。江蘇省徐州市感病的油菜、蘿卜及菠菜上分離到 3個(gè)蕪菁花葉病毒分離物位于 Basal-BR組［20］。表明basal-BR和 World-B組在我國(guó)的十字花科作物上普遍發(fā)生。對(duì)TuMV 序列進(jìn)行x系統(tǒng)進(jìn)化分析，能對(duì)其演變及致病性有深入的了解，可進(jìn)行抗病育種鑒定。如在澳大利亞?wèn)|部，一種新的蕪菁花葉病毒（TuMV）突變株克服了TuMV抗性基因，抑制了該病毒在甘藍(lán)型油菜作物中的傳播［26］。因此，對(duì)感染TuMV的甘藍(lán)分離物進(jìn)行序列分析研究，有望進(jìn)一步對(duì)我國(guó)甘藍(lán)品種選育進(jìn)行篩選鑒定，為TuMV的防控提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

在貴州甘藍(lán)種植區(qū)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，TuMV普遍發(fā)生危害，且引起甘藍(lán)花葉、黃化等典型癥狀，用酶聯(lián)免疫吸附法和分子生物學(xué)方法對(duì)貴州3個(gè)甘藍(lán)種植區(qū)6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的152份甘藍(lán)病毒病樣品進(jìn)行TuMV檢測(cè)，結(jié)果表明有5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢測(cè)出該病毒，陽(yáng)性檢出率為43.42%。用TuMV CP基因進(jìn)行序列分析表明，貴州TuMV甘藍(lán)分離物有兩個(gè)組群，分別為basal-BR和World-B組，除平壩有一個(gè)TuMV分離物聚在World-B組，多數(shù)TuMV分離物聚在basal-BR組。