韓利峰，歐陽(yáng)惠枝，張 雪，林亞娟，徐 偉，王曉穎

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

聚合物膠束（polymeric micelles，PMs）由兩親性高分子聚合物在水性環(huán)境中自組裝形成，其由親水性外殼和疏水性內(nèi)核組成且具有納米級(jí)粒徑結(jié)構(gòu)的載體［1-2］，能將疏水性藥物包載于其疏水內(nèi)核中，以增加水難溶性藥物的溶解度［3］。阿霉素（DOX）又稱多柔比星，通過(guò)插入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)及抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOP2）的功能，破壞DNA結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用［4］。但其溶解度低且無(wú)靶向性，易被糖蛋白外排引起多藥耐藥性，并且在臨床應(yīng)用中易引發(fā)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)［5-6］。本課題組前期以維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、羧甲基殼聚糖（CMCS）、甘草次酸（GA）和大黃酸（R）為原料，分別合成了TPGS-甘草次酸偶聯(lián)物（TG偶聯(lián)物）和TPGS修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物（TCR偶聯(lián)物），本研究以TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的混合物（TCR-TG）作為載體材料，制備載DOX的納米膠束（DOX／TCR-TG膠束），并進(jìn)行了制備工藝優(yōu)化，為克服DOX臨床應(yīng)用缺陷尋找解決辦法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與材料 TG偶聯(lián)物、TCR偶聯(lián)物（自制）；鹽酸阿霉素（DOX·HCl，大連美倫生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純）、葡萄糖（分析純）、甘露醇（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MWCO 14000透析袋（上海綠鳥(niǎo)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 儀器 NICOMPTM 380ZLS動(dòng)態(tài)激光粒徑測(cè)定儀（美國(guó)Santa Bbarbara公司）；MS105DU十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）。

2 方 法

2.1 DOX含量測(cè)定方法的建立 采用紫外-分光光度法對(duì)DOX／TCR-TG膠束中DOX的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 分別取DOX·HCl、TPGS、GA和R適量，用甲醇溶解稀釋至合適濃度，在波長(zhǎng)200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定DOX含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取2 mg的DOX·HCl，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.2 mg／mL的DOX儲(chǔ)備液，將此溶液稀釋為 10、15、20、25、30 和 40 μg／mL的系列濃度，以甲醇為空白溶液，在檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，以吸光度A對(duì)濃度C（μg／mL）進(jìn)行線性回歸。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取 15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，以甲醇為空白溶液，測(cè)定其吸光度值，計(jì)算RSD值。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取TCR-TG載體材料6 mg，用1 mL水溶解，取100 μL置于5 mL容量瓶中，加入 0.2 mg／mL DOX·HCl儲(chǔ)備液，甲醇稀釋至刻度，分別配制成15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，每個(gè)濃度3份，在檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率。

2.2 載藥膠束制備及工藝考察

2.2.1 DOX·HCl脫鹽 精密稱取適量 DOX·HCl，用適量DMSO溶解后，磁力攪拌下加入三乙胺（DOX·HCl∶TEA＝1∶3，n／n），攪拌過(guò)夜，即得脫鹽后 30 mg／mL DOX的DMSO溶液。

2.2.2 DOX／TCR-TG膠束制備 采用透析法制備，稱取TCR偶聯(lián)物和TG偶聯(lián)物的混合載體材料18 mg，加超純水3 mL，冰水浴探頭超聲10 min，緩慢滴加濃度為30 mg／mL DOX的DMSO溶液352.9 μL到TCR-TG混合載體溶液中，劇烈攪拌20 min后，冰水浴探頭超聲30 min，置透析袋中，蒸餾水為透析介質(zhì)，透析12 h。結(jié)束透析后，冰水浴探頭超聲20 min，用0.8 μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥即得DOX／TCR-TG膠束。

2.2.3 TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物混合比例考察 按照 TG 偶聯(lián)物與 TCR 偶聯(lián)物質(zhì)量比為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2 和 1∶3 稱取混合偶聯(lián)物共 18 mg，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備DOX／TCR-TG膠束，滴加400 μL DOX的DMSO溶液（30 mg／mL），考察TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的不同混合比例對(duì)TCR-TG混合載體載藥的影響。

2.2.4 藥物與載體的質(zhì)量比（藥載比，m／m）的考察稱取 “2.2.3”項(xiàng)下篩選得到的最佳混合比例載體材料，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，改變DOX的質(zhì)量來(lái)考察藥載比為 1∶1、1∶1.3、1∶1.5、1∶1.7 和 1∶2 時(shí)，對(duì)載藥的影響。

2.3 DOX／TCR-TG膠束凍干制劑的制備 采用冷凍干燥技術(shù)將膠束凍干成固體，以利于膠束長(zhǎng)期儲(chǔ)存。以載藥膠束凍干后外觀、再分散性、粒徑及分布、載藥量和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其凍干制劑進(jìn)行研究。

2.3.1 載藥膠束凍干制劑的制備 以“2.2”項(xiàng)下篩選的最佳比例按透析法制備DOX／TCR-TG膠束。結(jié)束透析后，冰水浴探頭超聲20 min，加入適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑，用0.8 μm濾膜過(guò)濾，冷凍干燥即得。

2.3.2 凍干保護(hù)劑考察 以甘露醇和葡萄糖為凍干保護(hù)劑，其用量均為0.1%、0.2%和 0.4%（m／v），按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，考察上述凍干保護(hù)劑對(duì)DOX／TCR-TG膠束的外觀、再分散性、粒徑及分布、載藥量和包封率的影響。

2.4 載藥量和包封率的測(cè)定 采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定DOX／TCR-TG膠束的載藥量（drug loading capacity，DL）及其包封率（entrapment efficiency，EE）。精密稱取 4 mg DOX／TCR-TG 膠束，加2 mL純水溶解，取250 μL用甲醇稀釋至5 mL容量瓶，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定DOX吸光度值，并計(jì)算DOX的濃度，根據(jù)下列公式計(jì)算DOX／TCR-TG膠束的DL和EE。

上式中，m1為載入膠束中的DOX的量，m2為DOX的投藥量，m為DOX／TCR-TG膠束的質(zhì)量。

2.5 DOX／TCR-TG膠束的粒徑及分布 稱取4 mg DOX／TCR-TG膠束，冰水浴探頭超聲10 min，配制成1 mg／mL的膠束水溶液，用0.8 μm濾膜過(guò)濾，常溫下用激光粒度儀（DLS）測(cè)定膠束的粒徑及分布。

2.6 DOX／TCR-TG膠束的形態(tài)學(xué)研究 使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察載藥納米膠束的形貌。取適量DOX／TCR-TG膠束溶液，滴于銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余的溶液，2%的磷鎢酸溶液負(fù)染，室溫干燥，于透射電鏡下觀察拍照。

3 結(jié) 果

3.1 DOX含量測(cè)定方法的建立

3.1.1 DOX含量檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 對(duì)DOX·HCl、TPGS、GA和R進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，以甲醇為空白對(duì)照，確定在498 nm為DOX的測(cè)定波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下其他各成分對(duì)DOX測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

3.1.2 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 吸光度A對(duì)濃度C（μg／mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為 A＝0.020 7C－0.022 2（r＝0.999 5），在 15～40 μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度和回收率 高、中和低3個(gè)濃度的精密度與回收率均符合方法學(xué)要求，其中日內(nèi)精密度RSD值分別為0.72%、0.39%和0.73%；日間精密度分別為1.06%、1.42%和1.18%；回收率分別是（100.11±0.98）%、（101.98±2.61）%和（99.70±1.91）%。

3.2 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比例的影響TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比例對(duì)包載DOX的影響，見(jiàn)表1。TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比為2∶1、1∶1 和 1∶2 時(shí)，載藥量和包封率均較其他比例的高，粒徑相差不大，且混合比為1∶2時(shí)，Zeta電位值為（-20.07±2.76）mV，穩(wěn)定性更好，故確定 TG 偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物的混合投料比為1∶2。

表1 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物比例對(duì)載藥能力的影響

表1 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物比例對(duì)載藥能力的影響

TG∶TCR／（m ／m）3∶1 2∶1 1∶1 1∶2 1∶3 1∶4粒徑／nm 118.97±2.16 142.67±20.39 158.70±25.51 144.37±33.80 145.40±23.51 271.97±29.12粒徑分布／PDI 0.15±0.03 0.14±0.05 0.14±0.02 0.18±0.01 0.21±0.03 0.16±0.10 Zeta 電位 ／mV-4.23±5.39-14.03±1.63-15.87±4.51-20.07±2.76-16.86±6.42-15.05±1.75 DL／%22.54±2.77 25.77±1.63 25.68±1.37 26.45±1.36 23.48±1.43 20.53±3.36 EE／%42.35±4.90 53.34±1.29 53.54±7.39 56.12±4.44 50.73±4.50 41.14±7.28

3.3 藥載比的影響 藥物與載體材料的投料比對(duì)混合聚合物膠束包載DOX能力的影響見(jiàn)表2。由表可知，當(dāng)藥載比為1∶1時(shí)，載藥量最高，但其粒徑較大，Zeta電位絕對(duì)值最小，故穩(wěn)定性較差。而藥載比為 1∶1.7 時(shí)，其粒徑為（121.3±8.49）nm，且包封率達(dá)到（62.59±6.39）%，故綜合考慮粒徑及分布、Zeta電位、載藥量和包封率，最終確定藥物與載體的投料比為 1∶1.7。

表2 藥載比對(duì)載藥能力的影響

表2 藥載比對(duì)載藥能力的影響

DOX∶TCR-TG／（m／m）1∶1 1∶3 1∶1.5 1∶1.7 1∶2粒徑／nm 140.53±6.43 132.27±10.70 133.43±37.25 121.30±8.49 116.20±5.81粒徑分布／PDI 0.19±0.02 0.17±0.01 0.15±0.02 0.21±0.02 0.16±0.02 Zeta 電位 ／mV-17.39±1.23-20.63±2.59-20.33±0.8-21.90±0.2-20.80±2.6 DL／%33.26±2.59 29.06±1.13 27.94±0.69 31.22±3.19 23.59±1.15 EE／%47.46±2.58 51.11±1.55 54.85±1.95 62.59±6.39 55.61±4.51

3.4 不同凍干保護(hù)劑的影響 凍干保護(hù)劑對(duì)DOX／TCR-TG膠束凍干制劑研究結(jié)果見(jiàn)表3。DOX／TCRTG凍干制劑均具有良好的復(fù)溶性，復(fù)溶后均為紅色澄清透明液體。綜合考慮各考察指標(biāo)，最終選用0.1%甘露醇為凍干保護(hù)劑，雖然粒徑稍大，但其分布均勻，包封率、載藥量最好。

表3 不同凍干保護(hù)劑的影響

表3 不同凍干保護(hù)劑的影響

凍干保護(hù)劑無(wú)保護(hù)劑0.1%甘露醇0.2%甘露醇0.4%甘露醇0.1%葡萄糖0.2%葡萄糖0.4%葡萄糖粒徑／nm 133.77±9.15 160.57±21.72 137.97±7.15 136.70±1.22 137.57±1.27 128.20±2.43 131.17±6.37粒徑分布／PDI 0.14±0.01 0.11±0.04 0.11±0.01 0.09±0.03 0.10±0.03 0.12±0.01 0.10±0.02 Zeta 電位 ／mV-18.41±2.64-17.65±1.45-12.69±3.03-16.19±7.52-13.72±2.83-14.59±5.93-17.17±4.61 DL／%30.05±6.61 30.70±0.56 26.86±1.17 19.74±1.57 29.36±1.51 28.43±1.17 20.30±2.87 EE／%45.40±0.11 73.08±3.65 53.68±3.78 72.88±5.55 69.71±4.67 69.14±4.93 54.52±6.31

3.5 DOX／TCR-TG膠束粒徑及形態(tài)學(xué) DOX／TCRTG載藥膠束的粒徑分布如圖2所示，TEM形態(tài)學(xué)特征圖如圖3所示，由圖可見(jiàn)膠束粒徑分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)圓整。

4 討 論

透析法是將兩親性聚合物和藥物共同溶解于與水互溶的混合溶劑中，然后倒入透析袋中，置于水中透析除去混合溶劑，待溶劑除去完全，透析袋中便是包載藥物的膠束水溶液。透析法具有操作簡(jiǎn)單、載藥效率高等特點(diǎn)，故本研究采用透析法制DOX／TCR-TG混合膠束。

通過(guò)對(duì)DOX／TCR-TG膠束的粒徑及分布、載藥量和包封率的綜合評(píng)價(jià)，最終確定TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的最佳混合比例為1:2，DOX與TCR-TG載體的最佳藥載比為1:1.7，所制備載藥膠束粒徑較小，分布均勻，載藥量和包封率均較高，為后續(xù)深入研究該膠束遞藥系統(tǒng)奠定了良好的基礎(chǔ)。

本文所用載體材料TG偶聯(lián)物中甘草次酸具有肝靶向性，有利于引導(dǎo)DOX到達(dá)肝部治療肝癌；TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物中的TPGS具有P-糖蛋白抑制功能，有利于克服DOX在應(yīng)用中多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生；并且該兩種偶聯(lián)物混合后對(duì)DOX有良好的增溶作用，克服了DOX水溶性差的缺點(diǎn)。綜上，該混合膠束對(duì)DOX的包載和遞送作用具有較好的臨床應(yīng)用前景，其體內(nèi)、外研究將進(jìn)一步深入研究。