張 萍 ，王維斌 ，邵巖飛 ，陳錦明 ，俞 潔 ，3，4，高碧珍 ，3，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.中醫(yī)證研究福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建省中醫(yī)健康管理2011協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122；4.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是臨床常見的生殖內(nèi)分泌代謝性疾病，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量、生育及長期健康［1］。目前PCOS以藥物治療為主，雖短期內(nèi)可糾正其內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，恢復(fù)排卵，但一旦停用藥物之后極易復(fù)發(fā)。其理想治療藥物的研究也成為當(dāng)今的熱門，而臨床收集患者樣本較為困難。因此，建立理想的PCOS動物模型對藥物評價及后續(xù)研究具有重要意義。目前國內(nèi)外誘導(dǎo)PCOS動物模型主要以雄激素造模法最為多見，張曉薇等［2-5］運(yùn)用脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）復(fù)制 PCOS大鼠模型，此法是采用23日齡的SD大鼠，在其頸背部皮下注射DHEA 20 d。大鼠本身有較強(qiáng)的自愈能力，這對研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性有較大的影響，為防止模型自愈而恢復(fù)排卵，諸多研究者在藥物干預(yù)的同時每天持續(xù)注射 DHEA［6-8］。 而目前對于 20 d DHEA誘導(dǎo)的PCOS動物模型是否會恢復(fù)排卵以及是否持續(xù)造模效果更佳，尚無明確科學(xué)依據(jù)。在中藥治療PCOS模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究中，中藥干預(yù)時間一般是 4周［9-10］，因此本研究以20 d及48 d為臨界點(diǎn)，采用不同時長DHEA誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，比較二者模型的特點(diǎn)，為選擇合適的誘導(dǎo)時長提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 21日齡SPF級SD雌性大鼠28只，體質(zhì)量50～60 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心SPF級屏障系統(tǒng)中，許可證編號：SYXK（閩）2014-0005，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h周期性光照環(huán)境，普通飼料喂養(yǎng)（各成分熱量比例為：碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，包括纖維素在內(nèi)的其他成分8%）。除實(shí)驗(yàn)期外自由飲食、飲水。本研究所有相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)操作均符合動物倫理學(xué)，審批號：2019福中醫(yī)倫理字第（013）號。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 注射用大豆油劑（源葉生物有限公司，批號：T15S9Z70260）；DHEA（麥克林公司，批號：C10098326）；大鼠睪酮（testosterone，T）ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒、大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號：1901R、1901R、1901R）；HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180727）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超低溫冰箱（美國Ependorf公司）；包埋機(jī)、RM2245半自動切片機(jī)（德國徠卡公司）、Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；SIGMA冷凍高速離心機(jī)（3K30，德國sigma公司）；體式顯微鏡（TP630，蘇州神鷹光學(xué)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 臨用前將DHEA溶于注射用大豆油劑中，配制30 mg／mL質(zhì)量濃度的DHEA。

2.2 動物分組造模 21日齡SPF級SD雌性大鼠28只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，按體質(zhì)量從大到小依次編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只和造模組18只。正常組每日頸部皮下注射0.2 mL注射用大豆油劑，造模組同部位注射0.2 mL的DHEA，均連續(xù)注射20 d。第21天正常組和造膜組各取2只進(jìn)行卵巢組織HE染色觀察。造模組鏡下可見卵巢呈多囊樣變，無成熟卵泡，無卵母細(xì)胞及卵丘，卵巢顆粒細(xì)胞層多為1～3層，且排列稀疏，少見黃體，證明PCOS模型成功建立。隨后將造模組分為模型組Ⅰ和模型組Ⅱ各8只。正常組、模型組Ⅰ每日皮下注射0.2 mL的注射用大豆油劑，模型組Ⅱ每日皮下注射DHEA，均連續(xù)注射28 d。每日早晨9：00進(jìn)行1次陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察。將無菌棉簽，浸于生理鹽水中，插入大鼠陰道約0.5 cm，稍旋轉(zhuǎn)，涂于玻片上，置于95%乙醇中濕固定15 min，自然風(fēng)干后，行蘇木素-伊紅（HE）染色并觀察。

2.3 大鼠動情周期觀察 造模10 d后，連續(xù)行2個性周期（每個周期5 d）的大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察動情周期的變化，動情前期涂片特征：以小、圓、有核上皮細(xì)胞（鱗狀上皮細(xì)胞）存在為特征；動情期：以不規(guī)則（角質(zhì)化）的鱗狀上皮細(xì)胞為特征；動情后期：以白細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞為特征；動情間期：白細(xì)胞和圓上皮細(xì)胞出現(xiàn)為特征。參照文獻(xiàn)，大鼠失去規(guī)律的動情周期，或持續(xù)處于動情間期，則提示無排卵［2］。

2.4 標(biāo)本采集 造模第20天，晚8時開始禁食不禁水。翌日尾靜脈采血，分離血清用于T、FSH、LH檢測，隨后正常組及造模組各取2只麻醉（10%水合氯醛，3 mL／kg）行腹腔注射麻醉取卵巢，進(jìn)行卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察。第48天晚8時開始禁食不禁水，翌日稱重麻醉，腹主動脈采血4 mL，分離血清用于性激素檢測。分別完整取出雙側(cè)卵巢，剪去卵巢周圍脂肪組織，稱重并觀察其外觀。將大鼠雙側(cè)卵巢用PBS沖洗后置于EP管中，加入4%多聚甲醛，使其浸泡其中，待病理切片，用于卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察。

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 卵巢指數(shù) 于末次給藥后，晚8時開始禁食不禁水，于次日晨稱重。分別完整取出雙側(cè)卵巢，稱重并計算卵巢指數(shù)。

2.5.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 體式鏡下觀察卵巢組織外觀；選取卵巢的最大平面進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊分別以4 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色并觀察。

2.5.3 血清性激素檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中 T、FSH、LH 的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)后顯色的深淺即吸光度值的大小判斷標(biāo)本中待測抗體或抗原的濃度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。若計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性檢時，采用LSD方法分析比較組間差異，方差不齊時，兩兩比較選擇Dunnett T3方法；若不符合正態(tài)分布則進(jìn)行兩樣本或多組秩和檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)描述。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠體質(zhì)量比較 見表1、2。

表1 第21天正常組和造模組大鼠體質(zhì)量比較g

表1 第21天正常組和造模組大鼠體質(zhì)量比較g

組別正常組造模組鼠數(shù)10 18第21天186.418±15.176 189.457±17.016

表2 第49天3組大鼠體質(zhì)量比較g

表2 第49天3組大鼠體質(zhì)量比較g

組別正常組模型組Ⅰ模型組Ⅱ鼠數(shù)8 8 8第48天252.910±14.367 252.718±16.854 267.363±26.185

3.2 正常組和造模組大鼠動情周期變化 正常組動情周期變化規(guī)律，按照動情間期、動情前期、動情期、動情后期規(guī)律進(jìn)行；造模組動情周期失去規(guī)律性。見圖1～2。

3.3 體質(zhì)量和血清性激素水平比較 見表3～4。

3.4 卵巢組織HE染色 第21天正常組鏡下可見各級卵泡，成熟卵泡結(jié)構(gòu)完整（箭頭所指），有卵丘、卵細(xì)胞及放射冠，卵巢顆粒細(xì)胞層多為8～9層；造模組鏡下可見卵巢呈多囊樣變，閉鎖卵泡增多，無成熟卵泡（箭頭所指），無卵母細(xì)胞及卵丘，卵巢顆粒細(xì)胞層減少且排列稀疏。第49天正常組鏡下可見各級卵泡，成熟卵泡結(jié)構(gòu)完整（箭頭所指），有卵丘、卵細(xì)胞及放射冠，卵巢顆粒細(xì)胞層多為8～9層；模型組Ⅰ及模型組Ⅱ鏡下可見卵巢呈多囊樣變，無成熟卵泡（箭頭所指），無卵母細(xì)胞及卵丘，卵巢顆粒細(xì)胞層多為1～3層，且排列稀疏，少見黃體。與模型組Ⅰ相比，模型組Ⅱ黃體數(shù)量較少，卵泡呈變形狀態(tài)。見圖3～4。

表3 第21天正常組和造模組大鼠血清FSH、T、LH水平

表3 第21天正常組和造模組大鼠血清FSH、T、LH水平

注：與正常組比較，1） P＜0.01。

組別正常組造模組鼠數(shù)10 18體質(zhì)量／g 186.418±15.176 189.457±17.016 T ／（nmol／L）139.388±8.862 169.377±5.7521）FSH／（IU／L）27.918±1.702 27.478±2.245 LH／（ng／L）34.356±1.465 43.494±1.7581）

表4 第49天3組大鼠血清FSH、T、LH水平

表4 第49天3組大鼠血清FSH、T、LH水平

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組Ⅰ比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組Ⅰ模型組Ⅱ鼠數(shù)8 8 8體質(zhì)量／g 252.910±14.367 252.718±16.854 267.363±26.185 T ／（nmol／L）149.402±8.441 169.821±10.1801）194.722±11.1441）2）FSH／（IU／L）25.480±0.875 18.526±0.7751）19.483±0.5551）LH／（ng／L）28.023±1.122 33.170±2.0041）32.086±2.0701）

3.5 第49天卵巢組織形態(tài)觀察 正常組大鼠的卵巢形態(tài)正常，色澤紅潤；模型組Ⅰ卵巢表面蒼白，卵巢表面可見單個或較多的囊性擴(kuò)張卵泡；模型組Ⅱ呈乳白色樣變，見圖5。

3.6 第49天3組大鼠卵巢指數(shù)和黃體數(shù)比較 見表5。

表5 第49天3組大鼠卵巢指數(shù)和黃體數(shù)比較

表5 第49天3組大鼠卵巢指數(shù)和黃體數(shù)比較

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組Ⅰ比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

組別正常組模型組Ⅰ模型組Ⅱ黃體數(shù)／個21.875±4.622 16.250±5.1391）6.417±4.3342）4）鼠數(shù)8 8 8卵巢指數(shù)0.043±0.008 0.053±0.006 0.037±0.0163）

4 討 論

PCOS是常見的婦科內(nèi)分泌綜合征，臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕、高雄激素血癥等，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，其在國內(nèi)的發(fā)病率為8.25%，不孕率為27.8%［11］。受臨床采集樣本的限制，目前國內(nèi)外相關(guān)研究均以PCOS的動物實(shí)驗(yàn)為主，PCOS的確切病因及病理生理機(jī)制目前尚不明確，因此為深入探討PCOS的病因、病理生理及藥物治療機(jī)制，有必要建立PCOS動物模型。當(dāng)前認(rèn)可的PCOS造模方法主要包括雄激素法、雌激素法、胰島素（INS）聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素（HCG）造模法等［12-14］，其中以DHEA雄激素造模法最多見。然而大鼠自愈能力較強(qiáng)，這對藥物研究而言有較大的誤導(dǎo)性［15］。 張瑩等［6］為避免模型恢復(fù)排卵，在藥物干預(yù)的同時每天持續(xù)注射DHEA，但該模型是否存在自愈未見報道，不同時長DHEA誘導(dǎo)PCOS模型的性激素水平及卵巢形態(tài)學(xué)差異也不明確。因此，本研究采用不同時長DHEA誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，選取20 d及48 d兩個時間點(diǎn)，比較模型的特點(diǎn)，為選擇合適的誘導(dǎo)時長提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，第21天造模組T、LH水平高于正常組（P＜0.01），而FSH無明顯差異，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)卵巢組織結(jié)構(gòu)呈多囊樣變，根據(jù)其性激素水平及卵巢形態(tài)學(xué)改變，證明PCOS模型建立成功，這與他人研究結(jié)果一致［16］。比較第21天及第49天血清性激素水平可以發(fā)現(xiàn)，模型組Ⅰ停止造模后，其T、LH與正常組比較仍有統(tǒng)計學(xué)差異，模型組Ⅰ及模型組Ⅱ的FSH水平低于正常組（P＜0.01）。究其原因，可能是DHEA不溶于水，只能溶于油劑，注射后短期內(nèi)很難完全吸收。PCOS患者激素功能紊亂是由于下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能異常，卵巢內(nèi)過高的雄激素會使LH分泌呈正反饋，而FSH呈負(fù)反饋，使 LH／FSH 比例增大［17］。 本次實(shí)驗(yàn)中，DHEA 為外源性雄激素，尚未達(dá)到使FSH產(chǎn)生負(fù)反饋。因此，到后期完全吸收后，高雄激素水平抑制FSH的釋放［18］。 結(jié)果表明 DHEA 20 d誘導(dǎo)的PCOS模型，其藥物未被完全吸收，如要研究其激素水平，需預(yù)留一定時間使其吸收。

此外，本研究通過體式顯微鏡觀察各組卵巢組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與模型組Ⅰ相比，模型組Ⅱ黃體數(shù)量較少，卵泡呈變形狀態(tài)。卵巢表面蒼白，是雄激素刺激卵巢白膜而膠原化所致［18］，模型組Ⅱ白膜呈乳白色樣變，其白膜厚度比模型組Ⅰ厚，考慮與雄激素的持續(xù)刺激有關(guān)。卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化上，模型組Ⅰ及模型組Ⅱ鏡下可見卵巢呈多囊樣變，無成熟卵泡，無卵母細(xì)胞及卵丘，卵巢顆粒細(xì)胞層多為1～3層，且排列稀疏，少見黃體。模型組Ⅰ、模型組Ⅱ黃體個數(shù)低于正常組（P＜0.05，P＜0.01），模型組Ⅱ黃體個數(shù)少于模型組Ⅰ（P＜0.01）。計算各組大鼠卵巢指數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組Ⅰ卵巢指數(shù)高于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與他人研究結(jié)果相符［19］。同時發(fā)現(xiàn)模型組Ⅱ卵巢指數(shù)低于正常組及模型組Ⅰ（P＜0.05）。分析其原因，可能是垂體活動過度，促性腺素分泌異常，卵泡消耗加速，導(dǎo)致卵巢萎縮，形成纖維化的白色組織，囊狀卵泡的持久壓迫，也會使卵巢萎縮［20］?？梢?，DHEA持續(xù)造模會導(dǎo)致卵巢萎縮。

因此，采用DHEA誘導(dǎo)20 d的PCOS大鼠模型，經(jīng)歷4周后，模型不存在自愈，與持續(xù)造模相比更加簡便易行。同時誘導(dǎo)20 d的PCOS模型卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)以及激素水平變化也更符合臨床表現(xiàn)。