李亞軍 黃河 牛雅靜 李霞

摘要：[目的]篩選菊花花粉離體培養(yǎng)生活力測定的最佳培養(yǎng)基配方，探究花粉貯藏的最適溫度和耐貯藏時間，并挑選出較耐貯藏的菊花品種，為菊花新品種選育和種質資源保存提供參考。[方法]以10個菊花品種盛花期花粉為試驗材料，通過離體萌發(fā)測定法篩選菊花花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基，以該培養(yǎng)基測定花粉在4℃、-20℃和-80℃3種溫度下進行60d或120d貯藏周期的生活力變化趨勢觀測，每隔15d取樣檢測1次;對貯藏120d的花粉進行授粉，統(tǒng)計結實率。[結果]培養(yǎng)基為ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂的處理，10種花粉都能萌發(fā)，且萌發(fā)率較其他培養(yǎng)基有顯著差異;花粉貯藏60d后，所有花粉生活力均下降，其中‘5‘52‘64和‘854個品種花粉生活力下降較緩慢;4種花粉貯藏120d后，在-80℃貯藏的花粉生活力較高，花粉授粉后均能夠結實，且品種‘5花粉授粉結實率最高，平均每個授粉花序結實8粒。[結論]花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、植物品種基因型、貯藏溫度和貯藏時間都會影響菊花花粉生活力。本文研究表明，菊花花粉最適貯藏溫度為-80℃，品種‘5花粉可貯藏120d保持較高的授粉結實率，在雜交育種中可優(yōu)先考慮。

關鍵詞：菊花，花粉生活力，貯藏，授粉

中圖分類號：S682.1+1文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）03-0295-08

0 引言

（研究意義）花粉是植物遺傳信息的載體和交流工具，花粉貯藏是保存種質資源最簡潔、高效的途徑。在雜交育種工作中，花粉貯藏能夠解決親本花期不遇和遠距離雜交問題，打破雜交親本的空間和時間隔離。菊花（Chrysanthemum X morifolium Ramat.）是菊科菊屬植物，在世界各地園藝造景中廣泛應用，雜交育種是培育菊花新品種的主要手段。因而探討菊花花粉最佳貯藏條件對于解決菊花近緣屬間雜交以及品種間雜交所面臨的花期不遇或遠距離雜交等問題具有重要意義，同時在使用貯存花粉之前，選擇合適的方法對花粉生活力進行測定，可確保選擇了最優(yōu)花粉進行人工授粉而得到性狀優(yōu)良的后代。（前人研究進展）不同物種最適花粉貯藏條件差異較大，且同一物種花粉貯藏時間不同，最適溫度不同。如在月季、杜鵑花、接骨木等觀賞植物中發(fā)現，低溫干燥貯藏有利于延長花粉壽命;對海棠花粉和梅花花粉的研究發(fā)現，4℃是其花粉貯藏的最適溫度;而對大白花杜鵑花粉貯藏生活力的研究發(fā)現，花粉貯藏30d以內時，-80℃條件下貯藏花粉生活力最高，而貯藏30d以上時，-16℃條件下貯藏花粉生活力最高。此外，快速準確測定不同品種花粉生活力，可為正確選擇雜交組合提供重要的參考依據，也是保證雜交育種工作順利進行的關鍵。花粉生活力測定方法有染色法、活體萌發(fā)法、離體萌發(fā)法以及田間雜交授粉等方法，其中田間雜交授粉法和離體萌發(fā)法分別是定性測定和定量測定花粉生活力的有效方法，而離體萌發(fā)培養(yǎng)基的組分對花粉萌發(fā)也具有重要影響。（本研究切人點）關于菊花花粉貯藏方法已有研究，但研究的貯藏周期較短，并缺少相應的授粉結實率的驗證。（擬解決的關鍵問題）本研究以課題組自育的10個不同基因型菊花品種花粉為試驗材料，設置不同花粉萌發(fā)培養(yǎng)基和貯藏溫度，進行120d貯藏周期內花粉生活力的測定，并通過田間雜交授粉進一步驗證貯藏溫度對花粉生活力的影響。探究菊花花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，適合菊花花粉貯藏的溫度及適宜的貯藏時間，并尋找出10個菊花品種中較耐貯藏的品種，為菊花種質資源的保存及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為課題組通過荷蘭引進的Time小菊系列與中國傳統(tǒng)菊花雜交所獲得的10個優(yōu)良菊花品種：‘5、‘16、‘22、‘30、‘45、‘52、‘64、‘85、‘132、‘317（圖1）。該10個菊花品種觀賞性狀較好，但自然花期偏晚（表1），因此會與花期早的菊花品種出現花期不遇現象。2018年11月于各品種于盛花期晴天上午10：00～12：00時，在北京植物園宿根花卉園菊花圃內用毛筆將花粉掃至2mL離心管中并帶回實驗室進行貯藏和花粉生活力測定。

1.2花粉生活力測定

1.2.1 最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選 蔗糖和硼酸對花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長有重要作用，聚乙二醇（PEG）能夠促進菊花花粉對蔗糖和硼的吸收。本試驗共設7種花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基：①50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;②100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;③150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;④200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;⑤ME3+6g·L^-1瓊脂;⑥ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂;⑦ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂。其中ME3培養(yǎng)基配方參考Widrle-chner等的配方，7種培養(yǎng)基pH為5.8～6.0.

1.2.2離體萌發(fā)測定花粉萌發(fā)率 花粉萌發(fā)率是衡量花粉生活力的主要標志。取配制好的7種液體培養(yǎng)基50uL滴于載玻片上，取50uL蒸餾水滴人凹玻片凹槽內，然后將花粉均勻撒播在液體培養(yǎng)基表面，載玻片向內翻轉蓋到凹玻片上，保證花粉處在均衡的環(huán)境中。將凹玻片放人鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放人25℃恒溫箱中培養(yǎng)2h，在40倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，萌發(fā)的花粉管長度超過花粉直徑則為萌發(fā)。每個處理重復3次，每重復隨機選取3個視野觀察，每個視野的花粉總數大于50粒，統(tǒng)計花粉粒總數和已萌發(fā)花粉?？倲怠；ǚ勖劝l(fā)率=（已萌發(fā)的花粉粒數量/花粉?？倲盗浚?00%，取3個視野平均值作為花粉萌發(fā)率。

1.3貯藏條件設置

1.3.1花粉耐貯藏品種篩選 采集10個菊花品種盛花期花粉，并用2mL試管分裝成小份進行貯藏。測定10個品種花粉原始生活力和60d貯藏周期后花粉生活力，比較不同品種花粉生活力變化情況，篩選出生活力較高的菊花品種。之后繼續(xù)貯藏60d，比較貯藏周期120d后田間授粉結實率，篩選出花粉最耐貯藏品種。

1.3.2 貯藏溫度和貯藏時間對花粉生活力的影響將60d貯藏周期后篩選出的花粉繼續(xù)貯藏在4℃、20℃、-80℃條件下，每隔15d測定1次花粉生活力，繼續(xù)測定60d，觀察花粉在120d貯藏周期內不同溫度下不同貯藏時間段的生活力變化趨勢，得到花粉生活力維持在較高狀態(tài)且下降緩慢的臨界貯藏時間，以及在長期貯藏情況下的最佳貯藏溫度。同時在貯藏120d后，比較不同貯藏溫度下花粉的授粉結實率，進一步驗證菊花花粉貯藏的最適溫度。

1.4 田間雜交授粉

選取生長健壯，自然花期較早且具有較高觀賞性的菊花品種‘45作母本，通過花期調控使其在2019年3月開花;取在3種溫度下貯藏120d的貯藏花粉，以及經過花期調控于2019年3月開花的相對應品種的新鮮花粉分別作父本。根據Huang等對菊花舌狀花發(fā)育級別的劃分，選取舌狀花微微展開的S3級別花序進行剪辦、去雄和套袋。剪辦5～6d后，雌蕊成熟伸出花冠筒呈“Y”字形并伴有光澤，用毛筆蘸取采集的新鮮花粉和貯藏花粉分別涂抹于柱頭上進行授粉。每個雜交組合選擇10個花序授粉，每個花序授粉3～5次。2個月后采集干枯花序凈種，通過比較結實率進一步探索適合菊花花粉貯藏的溫度和耐貯藏的品種。

1.5 數據分析

用Excel軟件和SPSS軟件對測定數據進行處理及多重比較。

2結果與分析

2.1 最佳菊花花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

試驗選取了7種含有不同成分、可能適合菊花花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基，通過測定10個菊花品種花粉在7種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率，確定最適合菊花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基。

由表2可知，以50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸和ME₃+6g·L^-1瓊脂作為培養(yǎng)基進行花粉離體萌發(fā)測定時，10個菊花品種花粉萌發(fā)率全都為0;而150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、200g·L^-1蔗糖/0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂以及ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1脂作為花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基時，10個菊花品種花粉都有一定萌發(fā)率。說明低濃度蔗糖不適合菊花花粉萌發(fā)，較高濃度的蔗糖（>150g·L^-1）能夠促進花粉萌發(fā)，且單獨的ME3培養(yǎng)基不能促進花粉萌發(fā)。進行方差分析和多重比較，結果表明以7號培養(yǎng)基為花粉萌發(fā)培養(yǎng)基時，品種‘5、‘45、‘132的花粉萌發(fā)率最高，且與其他培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率有顯著差異;7號、6號和4號培養(yǎng)基中，品種‘162‘22‘30‘5‘64和‘317的花粉萌發(fā)率無顯著差異，但在7號培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率最高。說明在ME₃基礎上添加適當濃度PEG能夠提高菊花花粉萌發(fā)率。因此選擇7號培養(yǎng)基，即ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂培養(yǎng)基作為離體萌發(fā)法測定菊花花粉生活力的最佳培養(yǎng)基。

2.2 不同菊花品種花粉生活力的比較

花粉原始生活力對花粉貯藏壽命有較大影響，而原始生活力除了受花粉采集時間、植株開花狀態(tài)，當天氣候狀況等外界因素影響外，也因品種的不同而表現出較大差異。由表3可知，在試驗的10個菊花品種花粉中，品種‘5的花粉原始生活力以及貯藏60d后生活力與其他花粉相比均有顯著差異，且生活力最高，4℃、-20℃、-80℃貯藏60d后花粉萌發(fā)率分別為3.51%、3.61%、3.86%;另外9個品種的花粉在貯藏60d后生活力排名由高到低依次為‘85、‘16、‘22、‘52、‘132、‘64、‘45、‘30‘317。由圖2可知，10個菊花品種花粉在3種溫度下貯藏60d后生活力下降值從小到大依次為‘45、‘85、‘132、‘22、‘64、‘30、‘5、‘52、‘16‘317。綜合考慮10個小菊品種相關性狀，花粉原始生活力及貯藏60d后花粉生活力下降值，最終選擇‘5、‘52、‘64和‘85這4個品種的花粉進行120d貯藏周期內的最佳貯藏溫度篩選。

2.3 不同貯藏溫度及天數對菊花花粉生活力的影響

分別將在4℃、-20℃、-80℃ 3種溫度下貯藏120d的品種‘5、‘52‘64和‘85花粉在ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂的培養(yǎng)基上進行萌發(fā)率測定。由表3、4可以看出，隨著貯藏時間的延長，無論貯藏在哪種溫度下，4種花粉生活力都會逐漸降低。其中貯藏在-20℃的花粉生活力與貯藏在4℃花粉生活力相比，大部分有顯著差異，‘52花粉在貯藏60、75d時，-20℃貯藏與4℃貯藏的花粉生活力差異不顯著;貯藏在80"C的4種花粉生活力與貯藏在-2℃和4℃的花粉生活力相比，在每一個貯藏時間內均有顯著差異，說明-80℃更適合4種花粉的貯藏。在-80℃貯藏溫度下，‘5花粉和‘85花粉在貯藏1-30d時花粉生活力無顯著差異，‘52花粉和‘64花粉在貯藏1-60d內均有顯著差異，在貯藏60-75d時差異不顯著。綜上，在進行菊花花粉貯藏時，選擇-80℃貯藏，且貯藏周期在30d內，能夠保持花粉具有較高的生活力。

2.4 雜交授粉比較不同品種和貯藏溫度對花粉生活力的影響

雜交授粉法基本原理是根據果實和種子的形成情況判斷花粉生活力，該方法能夠更加真實客觀地反映花粉生活力。為了進一步探索貯藏溫度對菊花花粉生活力的影響，并篩選出耐貯藏菊花品種，將在3種溫度下貯藏了120d的4個品種貯藏花粉和新鮮花粉分別進行雜交授粉試驗，經過2個月得到雜交種子。表5為新鮮花粉做父本的授粉結果，表6為貯藏花粉做父本的授粉結果。

通過對比表中數據可知，貯藏花粉授粉后所得種子數明顯低于新鮮花粉授粉所得種子數，說明花粉經過一段時間貯藏后，花粉生活力會下降。品種‘5花粉經-80℃貯藏120d后，依然能夠結實，結實率顯著高于‘52花粉、‘64花粉和‘85花粉。4種花粉在4℃條件下貯藏120d后都不能結實;在-20℃條件下貯藏后，只有品種‘5花粉授粉能夠結實，其他3種花粉均無活性;在-80℃條件下貯藏后，4種花粉授粉都能夠結實。綜上可以看出，在經過120d貯藏后，品種‘5花粉依然有較高授粉結實率，是最耐貯藏品種;在4℃貯藏環(huán)境菊花花粉全部喪失生活力，在-20℃貯藏環(huán)境僅部分耐貯藏品種花粉可保持生活力，在-80℃貯藏環(huán)境大部分品種花粉均具有生活力，雜交授粉后能夠正常結實，說明-80℃更適合菊花花粉的長期貯藏。

3 討論與結論

3.1 離體萌發(fā)培養(yǎng)基對花粉生活力的影響

花粉是植物的雄配子體，是植物遺傳信息的載體和交流工具，花粉生活力的測定和貯藏條件的研究對于種質資源的保存和育種工作的開展具有重要意義。離體萌發(fā)法是測定大多數植物花粉生活力的常用方法，蔗糖、硼酸和鈣等微量元素是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的主要成分，但對不同植物所需要的濃度可能是不同的。玫瑰、牡丹等植物花粉萌發(fā)最適蔗糖質量濃度為100～150g·L^-1，文冠果花粉萌發(fā)培養(yǎng)基最適蔗糖質量濃度為150g·L^-1，花粉萌發(fā)率達到91.08%。在本研究中發(fā)現，在只添加蔗糖和硼酸的培養(yǎng)基中，200g·L^-1蔗糖質量濃度更有利于菊花花粉萌發(fā)。但蔗糖培養(yǎng)液對同屬于菊屬的南京野菊、毛華菊和幾種栽培小菊花粉萌發(fā)均沒有顯著效果，說明蔗糖對不同種或不同品種植物作用不同，因而在測定植物花粉生活力時，需要先篩選出適合該種花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，以使測定結果更準確。

PEG能夠使花粉內膜結構發(fā)生變化，使膜的通透性提高，從而促進花粉萌發(fā)和花粉管生長。在本研究中，10個菊花品種花粉在ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂培養(yǎng)基上均有相對較高的萌發(fā)率，且高于200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂，而花粉在單獨的ME₃培養(yǎng)基上萌發(fā)率為0，說明PEG能夠促進菊花花粉萌發(fā)。有研究發(fā)現在PEG基礎上添加一定量的蔗糖能顯著促進花粉萌發(fā)，但在二者的共同作用下，菊花花粉的萌發(fā)率是否大于單獨PEG或蔗糖對花粉萌發(fā)的作用，以及二者的最佳濃度配比是多少，都值得進一步研究。

3.2 貯藏環(huán)境對花粉生活力的影響

影響花粉生活力的因素除了花粉自身遺傳特性外，還有溫度、濕度、光照、輻射等環(huán)境因素，溫度和濕度是影響花粉貯藏壽命的主要因素。一般來說，植物花粉在低溫下貯藏壽命更長，能保持較高的花粉生活力，且溫度越低，花粉生活力下降越緩慢。例如聚石斛花粉在-20℃冷凍濕潤、-20℃冷凍干燥、4℃冷藏濕潤、4℃冷藏干燥4種條件下貯藏90d后，花粉生活力依次為21.7%、6.4%、1.4%和0.0%，無論是干燥還是濕潤條件下，-20℃條件下貯藏花粉生活力都要明顯高于4℃。在斑葉堇菜的研究中發(fā)現，花粉最佳貯藏條件為-80℃，在貯藏360d后，花粉萌發(fā)率仍達到40.50%。王濤等也曾對菊花花粉的貯藏條件進行研究，將菊花花粉分別以干燥和濕潤2種狀態(tài)貯藏在4℃、-20℃和-80℃條件下，發(fā)現水分和溫度是影響菊花花粉貯藏壽命的2個重要因素，菊花花粉適合濕潤貯藏，且-80℃更有利于菊花花粉的貯藏，但該研究僅探討了60d貯藏周期內菊花花粉的貯藏溫度，未進行更長周期的貯藏研究。本研究將10個菊花品種花粉分別貯藏在4℃、-20℃和-80℃條件下，并分別進行了60和120d貯藏周期研究，發(fā)現無論是短期貯藏還是長期貯藏，-80℃貯藏條件下，花粉生活力均高于其他貯藏條件下花粉生活力。同時，本研究也發(fā)現30d是菊花花粉貯藏時間節(jié)點，30d后花粉生活力均下降明顯，因此若進行短期貯藏，在30d內使用花粉可獲得較好的效果。但如果貯藏溫度繼續(xù)降低，花粉生活力是否會繼續(xù)升高，花粉貯藏時間節(jié)點是否能夠延長還有待進一步討論。

此外，并不是在所有植物中，低溫都更有利于花粉的貯藏，如對海棠花花粉的研究，發(fā)現最適貯藏條件是4℃;周婷等發(fā)現朱頂紅‘蘋果花品種花粉最適貯藏條件是4℃+干燥劑，90d后依然有較高的活性;劉穎等在對梅花花粉最適貯藏溫度的研究中，將梅花花粉分別貯藏在4℃、-20℃、-40℃、-80℃4種溫度條件下，發(fā)現最適貯藏溫度為4℃，溫度過低導致細胞脫水，反而不利于梅花花粉貯藏。說明對于不同種植物來說，花粉貯藏最適溫度不同，冷凍貯藏并不適合所有植物。

綜上所述，ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂是本研究中菊花花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，而在PEG基礎上添加一定量的蔗糖是否能夠進一步提高花粉萌發(fā)率有待進一步研究。4℃、-20℃、-80℃ 3種貯藏溫度相比，-80℃更適合菊花花粉貯藏，能夠使菊花花粉保持相對較高的生活力，可以考慮作為菊花遠距離雜交以及解決親本花期不遇時進行花粉貯藏的最適溫度。在貯藏過程中，菊花花粉生活力均隨著貯藏時間延長而下降，30d內花粉生活力差異不顯著，因而最好在30d內完成授粉以提高結實率。品種‘5花粉在-80℃貯藏120d后授粉依然能夠結實，在雜交育種親本選擇時可優(yōu)先考慮。