劉孝平 劉路 鄒雨珂 魯炫池 陳安均

摘? 要：為優(yōu)化羅望子果肉浸提工藝，提供羅望子果肉加工與羅望子果肉活性物質(zhì)研究的理論依據(jù)。本研究以多糖提取率、原料利用率、總酚提取率和總黃酮提取率為響應(yīng)值，以熵權(quán)法賦權(quán)，通過響應(yīng)面法對羅望子果肉纖維素酶法浸提工藝進行優(yōu)化，并對其浸提過程中浸提液的抗氧化活性變化進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅望子浸提液對于OH·清除能力極強，均大于190 mg/100 mL，OH·清除能力和ABTS+·清除能力對提取條件的變化敏感?？紤]實際情況得到最佳提取工藝的提取時間為51 min，料液比為1∶10.9（g/mL），纖維素酶添加量為質(zhì)量比1.5‰，在此條件下，羅望子果肉多糖提取率為12.66%，原料利用率為88.24%，總酚提取率為4.79‰，總黃酮提取率為4.38‰，與理論預(yù)測值接近。該模型能較好預(yù)測羅望子果肉的浸提工藝，可以用于保健飲料加工。

關(guān)鍵詞：羅望子;響應(yīng)面;熵權(quán)法;抗氧化

中圖分類號：TS255.44? ? ? 文獻標識碼：A

Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction of Active Substances from Tamarind Pulp Based on Entropy Weight Method

LIU Xiaoping， LIU Lu， ZOU Yuke， LU Xuanchi， CHEN Anjun*

College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Yaan， Sichuan 625014， China

Abstract： The study was aimed to optimize the extraction process of tamarind pulp. The polysaccharide extraction rate， raw material utilization rate， total phenolics extraction rate and flavonoids extraction rate were used as the response value， and the entropy weight method was used to optimize the cellulase extraction process. The antioxidant activity of the extract during the extraction process was studied. The results showed that the tamarind extract had strong OH· scavenging ability， and both were more than 190 mg/100 mL. The OH· scavenging ability and ABTS free radical scavenging ability were sensitive to the changes of extraction conditions. Considering the actual situation， the optimal extraction process was 51 min， the ratio of material to liquid 1∶10.9， and the amount of cellulase 1.5‰. Under this condition， the extraction rate of tamarind pulp polysaccharide was 12.66%， the yield was 88.24%， the total phenolics extraction rate was 4.79‰ and the total flavonoid， extraction rate was 4.38‰， which was close to the theoretical prediction. The model could well predict the extraction process of tamarind pulp， which could be used in health beverage processing.

Keywords： Tamarindus; response surface; entropy weight method; antioxidant

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.023

羅望子（Tamarindus indica L.），又名酸角、酸豆，是一種蘇木科（Caesalpiniaceae）酸豆屬（Tamarindus）的高大喬木植物[1]。主要分布在全世界熱帶亞熱帶地區(qū)，我國主產(chǎn)區(qū)為云南、四川兩省境內(nèi)的金沙江干熱河谷[2]。羅望子的氣味芳香，可直接食用，也可加工成果汁、果醬和調(diào)味料等產(chǎn)品。羅望子果肉中含有豐富的糖類，其中還原糖含量高達33.33%，這在眾多水果中都屬少見[3]。羅望子還是一種食藥同源的植物，羅望子果肉有抑菌、降血糖、抗突變等功效[4]。Martinello等[5]以70%乙醇對羅望子果肉進行了提取，提取物中糖類、酚類和黃酮類化合物含量較高，具有較強的DPPH·清除能力，且能夠顯著降低高膽固醇血癥的倉鼠血清總膽固醇水平。Tril等[6]同樣發(fā)現(xiàn)羅望子果肉提取物具有抗革蘭氏陽性和抗革蘭氏陰性細菌的抗菌活性，且在水提物中總酚含量為3.28 mg/g，黃酮含量為43.34 mg/g，且具有較強的DPPH·清除能力和鐵離子還原能力。Sharma等[7]對羅望子果肉多糖進行了提取，發(fā)現(xiàn)其DPPH·的半數(shù)抑制濃度為0.05 mg/mL，顯著低于蘋果果膠和商業(yè)果膠。然而，目前對羅望子具體的藥理作用機制還不明確，但多糖、酚類和黃酮類物質(zhì)被證明是羅望子果肉中活性較高的物質(zhì)。

目前對羅望子果肉浸提取汁工藝優(yōu)化相關(guān)研究極少，羅望子果肉水分含量低，含有大量果膠、纖維素、半纖維素等物質(zhì)，難以用壓榨法取汁。如果單獨采用浸提法原料利用率低，且浸提溫度較高、浸提時間較長，容易造成熱敏性物質(zhì)的降解。纖維素酶通過對植物細胞壁的破壞，提高細胞壁的透過性，有助于細胞內(nèi)溶物溶出，且酶提取法具有提取條件溫和和提取效率高等優(yōu)點。熵權(quán)法是一種客觀賦權(quán)法[8-9]，利用指標的變異性大小確定權(quán)重，其優(yōu)點是不摻雜主觀判斷，更科學地進行多指標的綜合評價。為提高羅望子果肉浸提的效率，并盡可能減少對活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，本研究采用纖維素酶和熱水浸提相結(jié)合的方法，對羅望子果肉浸提取汁工藝進行了優(yōu)化，旨在為今后的羅望子果肉加工利用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 羅望子由昆明市建航商貿(mào)有限公司提供;蒽酮、3，5-二硝基水楊酸、福林酚、沒食子酸、蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼等均為分析純，購于成都科隆化學品有限公司;纖維素酶（酶活力：1×105 U/g，最適溫度50 ℃，最適pH 4.8），購于和氏璧生物科技有限公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? Thermo BR4i型冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司;Varioskan Flash型熒光酶標儀，美國賽默飛世爾科技有限公司;HZ85-2型磁力攪拌機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 羅望子果肉提取液的制備? 將新鮮的甜型羅望子去殼去籽得到羅望子果肉，所得果肉混合均勻后于?20 ℃儲藏備用。稱取適量的羅望子果肉按比例加入水后打漿1 min，根據(jù)底物質(zhì)量加入纖維素酶，在50 ℃條件下水浴一定時間，6000 r/min離心10 min得到提取液。

1.2.2? 單因素及響應(yīng)面實驗設(shè)計? 固定料液比為1∶9、纖維素酶添加量為質(zhì)量比0.12‰、酶解時間為40 min，控制料液比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15（g/mL），纖維素酶添加量為質(zhì)量比0‰、0.6‰、1.2‰、1.8‰、2.4‰，酶解時間為0、20、40、60、80 min進行實驗，選取出較優(yōu)提取條件進行響應(yīng)面實驗。

1.2.3? 提取液多糖含量及多糖提取率的測定? 采用蒽酮-硫酸法[10]測定羅望子果肉提取液中總糖含量。提取液中還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法[11]測定，用公式（1）計算提取液中多糖提取率。

多糖含量=（總糖含量?還原糖含量）/果肉干重×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

1.2.4? 總酚的測定? 采用Folin-Ciocalteus法，取樣品0.4 mL，加入2 mL稀釋10倍的Folin酚試劑，反應(yīng)5 min后加入10% NaCO3溶液3 mL，混合均勻后常溫放置1 h，于765 nm處測定OD值，對比相應(yīng)的沒食子酸標準曲線計算總酚含量。

1.2.5? 總黃酮的測定? 采用分光光度法，吸取稀釋了2倍的樣品溶液0.3 mL，加入30%的乙醇3.4 mL和0.5 mol/L的NaNO2 0.5 mL，6 min后加入0.3 mol/L的AlCl3·6H2O 0.15 mL，6 min后在410 nm處測定OD值，并對比相應(yīng)蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

1.2.6? OH·清除能力測定? 取羅望子果肉浸提液按比例稀釋至料液比為1∶15（g/mL），再將稀釋后的提取液稀釋10倍后參考楊江濤等[12]的方法測定，以抗壞血酸當量計算浸提液的OH·清除能力。

1.2.7? DPPH·清除能力測定? 取羅望子果肉浸提液按比例稀釋至料液比為1∶15（g/mL），參考Razali等[13]的方法測定，以抗壞血酸當量計算浸提液的DPPH·清除能力。

1.2.8? ABTS+·清除能力測定? 取羅望子果肉浸提液按比例稀釋至料液比為1∶15（g/mL），參考曾慧婷等[14]的方法測定，以抗壞血酸當量計算浸提液的ABTS+·清除能力。

1.2.9? 原料利用率? 分別精確稱取提取前果肉重量和提取后殘渣重量，測定含水量，以干物質(zhì)重量計算羅望子果肉利用率。

1.3? 數(shù)據(jù)標準化方法

采用離差標準化法對數(shù)據(jù)進行標準化，消除量綱和變異大小因素的影響，便于不同單位或量級的指標能夠進行比較和加權(quán)。

1.4? 權(quán)重系數(shù)的計算

采用熵權(quán)法計算指標的權(quán)重，各指標的權(quán)重值為wj。將標準化后的數(shù)據(jù)進行公式（2）運算得到第j項指標的信息熵Ej。

（2）

式中，dij表示為第j個指標下第i個項目的評價值;pij表示第j個指標下第i個項目的指標值的比重;m表示評價對象的數(shù)量;n表示評價指標的數(shù)量。其中，如果pij=0，則定義。

按照公式（3）計算各指標的客觀權(quán)重值。

（3）

1.5? 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用Origin 8.0進行繪圖，采用Minitab 17進行相關(guān)性分析，采用Design-Ex pert 8.0.6二次回歸旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素實驗結(jié)果分析

如圖1可知，在纖維素酶添加量為1.2‰、提取時間為40 min的條件下，在料液比為1∶3（g/mL）時，多糖提取率、總酚及總黃酮提取率均較低，原料利用率不高。在提高料液比的過程中，三者提取率均顯著升高，當料液比達1∶9（g/mL）后，繼續(xù)增加水的比例對總酚及總黃酮的提取率的提高影響不大，且水的比例繼續(xù)增加可能造成纖維素酶濃度的降低，進而導致多糖提取率降低，所以選擇料液比1∶9（g/mL）作為較優(yōu)條件進行下一步實驗。

由圖2可知，在提取時間為40 min、料液比為1∶9（g/mL）的條件下，纖維素酶添加量在0‰～1.2‰范圍內(nèi)隨加酶量的增加，3種活性物質(zhì)的提取率顯著增加。當纖維素酶添加量到達1.2‰后，繼續(xù)提高酶濃度3種活性物質(zhì)提取率沒有顯著提升，說明酶的添加量增加到一定程度后，繼續(xù)添加酶已經(jīng)沒有足夠的底物與之進行反應(yīng)，因此三者的提取率不再上升。而在酶添加量較高時，總酚提取率發(fā)生下降可能是纖維素酶對果肉細胞的破壞導致一些多酚氧化酶的釋放與酚類物質(zhì)作用。綜合考慮生產(chǎn)成本的因素，選擇較優(yōu)纖維素酶添加量為1.2‰進行下一步實驗。

由圖3可知，在纖維素酶添加量為0.12‰的條件下，隨提取時間延長，多糖提取率隨時間延長提升不顯著，而總酚、總黃酮提取率顯著上升。由圖3可知，當提取時間到達40 min后，繼續(xù)延長提取時間，多糖提取率不再上升，而多酚、黃酮提取率下降可能是多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性較差而發(fā)生氧化。綜合考慮能源因素及生產(chǎn)成本，選擇提取時間40 min為較優(yōu)條件進行下一步實驗。

2.2? 提取條件對浸提液體外抗氧化能力的影響

由圖4可知，浸提液對3種自由基均具有較強的清除能力，尤其對于OH·清除能力均在190 mg/100mL以上。浸提液對不同自由基清除能力大小為OH·>ABTS+·>DPPH·，浸提液對于不同自由基清除能力有著巨大差異可能是由于浸提液中活性物質(zhì)組成和維生素C對不同自由基清除能力的差異有關(guān)。隨著料液比、纖維素酶添加量、提取時間的增加，浸提液對于OH·和ABTS+·清除能力顯著增加，而提取液對DPPH·清除能力沒有顯著提升。但是當提取時間達到40 min后，繼續(xù)延長提取時間會造成浸提液對OH·清除能力的減弱。

2.3? 相關(guān)性分析結(jié)果

由表1可知，3種活性物質(zhì)提取率與浸提液對各個自由基清除能力之間均呈正相關(guān)。其中，OH·清除能力和ABTS+·清除能力與3種活性物質(zhì)提取率均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在0.850以上。而浸提液DPPH·清除能力僅表現(xiàn)出對總酚和黃酮提取率有著極顯著正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)均在0.850以下，而浸提液DPPH·清除能力對于多糖提取率相關(guān)性不顯著，這說明活性物質(zhì)的溶出有助于提高浸提液的抗氧化活性。

2.4? 回歸旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計及結(jié)果

通過單因素實驗得到的較優(yōu)條件，利用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計進行進一步的優(yōu)化，實驗設(shè)計和結(jié)果分別見表2和表3。利用Design-Expert軟件建立各指標和因素之間的回歸模型，去除不顯著的乘積項之后，統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。Y1、Y3、Y4的回歸模型擬合度均較高，R2均在0.9以上。所有指標的回歸模型均達到極顯著水平（P< 0.01），失擬項均不顯著（P>0.05）。說明各指標的回歸模型均能在一定因素水平范圍內(nèi)反映該指標的變化規(guī)律。

2.5? 綜合評分及回歸模型及方差分析

根據(jù)響應(yīng)面實驗結(jié)果，利用熵權(quán)法對各個響應(yīng)值賦權(quán)值得到權(quán)重系數(shù)，多糖提取率為0.1855、原料利用率為0.1988、總酚提取率為0.3086、總黃酮提取率為0.3094。得到的綜合評分結(jié)果如表5，各因素與綜合評分回歸模型的方差分析結(jié)果如表6。模型極顯著，失擬項不顯著，決定系數(shù)為0.9931，說明回歸模型依然能很好地與所選變量進行擬合，綜合評分法用于羅望子果肉浸提工藝是穩(wěn)定可靠的。去除不顯著的乘積項后得到的回歸方程為：

2.6? 交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面的等高線的形狀可判斷響應(yīng)值與各因素間的相互作用，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱[15]。如圖5，酶添加量和料液比交互作用的響應(yīng)面圖坡度最大，可見這2個因素對綜合評分的影響最顯著。酶添加量與料液比的等高線近似圓形，可知它們之間的相互作用對綜合評分的影響較小。而料液比與提取時間、酶添加量與提取時間的等高線呈扁平狀，說明這2組因素之間的相互影響較強。

2.7? 羅望子果肉多糖提取的最優(yōu)條件的確定和驗證

利用Design Export軟件建立綜合評分和各因素間的回歸模型，分析數(shù)據(jù)得到羅望子果肉多糖浸提的最佳工藝條件為提取時間51.25 min，料液比1∶10.86（g/mL），纖維素酶添加量1.52‰?？紤]到實際因素，將提取條件設(shè)定為提取時間51 min，料液比1∶10.9，纖維素酶添加量1.5%。此條件下的模型預(yù)測值為羅望子果肉多糖提取率為12.66%，原料利用率為88.24%，總酚提取率為4.71‰，總黃酮提取率為4.25‰，模型實測值為羅望子果肉多糖提取率為12.49%，原料利用率為87.65%，總酚提取率為4.79‰，總黃酮提取率為4.38‰，提取液各指標實測值與理論值相對誤差均小于5%，因此可將該優(yōu)化模型用于羅望子果肉的浸提工藝，具有一定的準確性和可靠性。

3? 討論

本研究采用纖維素酶法優(yōu)化羅望子果肉浸提工藝，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，并以熵權(quán)法對各響應(yīng)值賦權(quán)值。結(jié)果表明，在提取過程中浸提液抗氧化活性與活性物質(zhì)提取率呈正相關(guān)，浸提液對OH·清除能力達到194.72～290.87 mg/100 mL，對ABTS自由基及DPPH自由基也有較強的清除能力。這與羅望子果肉浸提液中活性物質(zhì)組成及化學特性密切相關(guān)，研究表明多糖類物質(zhì)[16]、酚類物質(zhì)[17]和黃酮類物質(zhì)[18]對這幾種自由基有較強的清除能力。

通過各因素對綜合評分建立回歸模型結(jié)果表明，考慮實際情況得到最佳提取工藝的提取時間為51 min，料液比為1∶10.9（g/mL），纖維素酶添加量為1.5%。在此條件下，羅望子果肉多糖提取率為12.66%，原料利用率為88.24%，總酚提取率為4.79‰，總黃酮提取率為4.38‰，與理論預(yù)測值接近，說明該模型能較好預(yù)測羅望子果肉的浸提工藝。熱水浸提法提取羅望子果肉多糖提取率為8.54%[19]，比本研究中羅望子果肉多糖提取率低，進一步說明纖維素酶處理能夠提高羅望子果肉的浸提效率?？偡雍涂傸S酮提取率與Tril等[6]的研究相近;但Martinello等[5]以乙醇為溶劑對羅望子果肉進行提取，得到了更高的提取率，這可能與提取溶劑的不同密切相關(guān)，根據(jù)相似相溶的原理，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)在低極性的溶劑中溶解度更大[20]。在羅望子果肉浸提工藝多指標決策的過程中，權(quán)重問題的研究有著重要的地位。熵權(quán)法作為一種客觀權(quán)重法，可以很好地避免人為主觀選擇、偏好等對評價結(jié)果的影響。有學者將其與響應(yīng)面法結(jié)合用于中藥的提取研究，可最大程度地保留中藥中原有的臨床有效物質(zhì)[21-22]。本研究將其應(yīng)用于羅望子果肉浸提工藝同樣取得了很好的擬合效果，得到了品質(zhì)較好的羅望子果肉浸提液，降低了生產(chǎn)成本。

浸提工藝是果蔬汁生產(chǎn)的關(guān)鍵工藝之一，本研究所建立的模型較好地擬合羅望子果肉浸提工藝，可以進一步應(yīng)用于保健飲料加工。羅望子浸提液表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，可作為天然的新型抗氧化劑進一步研究。

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