馬小偉 安鋒 劉子凡 謝貴水

摘? 要：鋁毒是熱帶地區(qū)酸性土壤上抑制作物生長(zhǎng)的主要因素，但目前關(guān)于鋁活化后對(duì)橡膠樹生長(zhǎng)和產(chǎn)膠的影響及橡膠樹耐鋁機(jī)制的研究很少。為了篩選出橡膠樹在鋁毒脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，本研究選擇了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10種常見的基因作為候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR檢測(cè)，利用內(nèi)參基因評(píng)價(jià)軟件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及綜合評(píng)價(jià)軟件RefFinder對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，鋁脅迫后表達(dá)穩(wěn)定性排名前3的內(nèi)參基因依次分別為UBC4、40S rRNA和FP。進(jìn)一步選取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因組合以及穩(wěn)定性較差的GAPDH基因作為內(nèi)參基因?qū)ο鹉z樹鋁誘導(dǎo)蘋果酸分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，結(jié)果顯示2個(gè)目的基因相對(duì)于3個(gè)內(nèi)參基因及其組合均顯示出一致的表達(dá)水平，而穩(wěn)定性較差的內(nèi)參基因GAPDH未能準(zhǔn)確地對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行校正。綜上所述，篩選出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因組合可作為鋁毒脅迫不同天數(shù)下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，可用于鋁毒脅迫下橡膠樹相關(guān)基因的表達(dá)分析。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;鋁毒;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;內(nèi)參基因

中圖分類號(hào)：S718.43? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Screening of Reference Genes for Quantitative Real-time PCR of Rubber Saplings under Aluminum Stress

MA Xiaowei1，2， AN Feng2*， LIU Zifan1*， XIE Guishui2

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： Aluminum toxicity is a major factor inhibiting crop growth on tropical acidic soils. However， the study on the effects of aluminum toxicity on rubber tree growth and latex production is limited， the mechanism of rubber trees tolerate to aluminum has not been reported. To screen the reference genes stably expressed in rubber trees while aluminum stress and elucidate the molecular mechanism of rubber tree aluminum tolerance by real-time quantitative PCR assay， ten candidate internal reference genes， i.e. Actin， Actin7， 18S rRNA， 40S rRNA， YLS8， UBC2， UBC4， GAPDH， FP and ADF were selected in this study. The expression stability was analyzed with geNorm， NormFinder， BestKeeper and Delta Ct and RefFinder. The expression stability of the ten candidate internal reference genes were different. The top three stable reference genes were UBC4， 40S rRNA and FP. Meanwhile， the expression of two aluminum-induced malate transporter genes （HbALMT-1 and HbALMT-2） in rubber trees were verified with UBC4， 40S rRNA， FP， the combination of top three stable genes （UBC4+40S rRNA+FP） and the unstable gene GAPDH. The expression profiles of the two target genes were consistent when normalized by three reference genes and the combinations. The unstable reference gene （GAPDH） failed to standardize the expression data. In conclusion， UBC4， 40S rRNA and FP genes and the combinations were selected as the most stable reference genes， which could be normalized the expression of the relative genes under aluminum stress.

Keywords： rubber tree; aluminum toxicity; quantitative real-time PCR; reference gene

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.015

全球約有40%～50%的潛在可耕種土地屬于酸性土壤，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。目前，由于不恰當(dāng)?shù)母鞣绞健⑺嵊甑拳h(huán)境問題的影響，土壤酸度呈逐漸增加的趨勢(shì)[2]。鋁毒是酸性土壤上限制作物產(chǎn)量的主要因素。鋁作為一種金屬元素，廣泛地分布于土壤礦物質(zhì)中，通常是以對(duì)植物生長(zhǎng)無毒的硅酸鹽或氧化物形式存在[3]。當(dāng)pH<5時(shí)，土壤中的鋁則會(huì)形成可溶性的Al3+和作物根系結(jié)合，即使在微摩爾級(jí)別也可在數(shù)小時(shí)內(nèi)抑制作物根系的生長(zhǎng)，影響作物正常吸收水分和養(yǎng)分的能力，進(jìn)而影響作物地上部的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的形成[4]。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬大戟科（Euphorbiaceae）橡膠樹屬（Hevea）多年生喬木，是生產(chǎn)天然橡膠的重要來源，主要種植于土壤酸化嚴(yán)重的熱帶地區(qū)。關(guān)于橡膠樹鋁毒和耐鋁機(jī)制的研究報(bào)道較少，僅見張晗等[5]和安鋒等[6]采用河沙和石英砂盆栽試驗(yàn)研究了鋁脅迫對(duì)橡膠苗部分生理指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)橡膠苗對(duì)鋁的耐受濃度達(dá)到100～200 mmol/L，遠(yuǎn)高于其他作物對(duì)鋁的耐受濃度，這對(duì)進(jìn)一步研究橡膠樹的耐鋁機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，針對(duì)橡膠樹耐鋁的分子機(jī)理還未見相關(guān)報(bào)道。因此，探明橡膠樹耐鋁的分子機(jī)理對(duì)于減輕鋁對(duì)橡膠樹生產(chǎn)和產(chǎn)膠的可能傷害、提高酸性土壤上天然橡膠的產(chǎn)量都具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）是現(xiàn)代分子生物學(xué)試驗(yàn)中常用的技術(shù)，可以對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[7]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在試驗(yàn)中容易受到試驗(yàn)樣品差異、提取RNA質(zhì)量、cDNA數(shù)目和質(zhì)量、引物設(shè)計(jì)的合理性以及PCR反應(yīng)條件等因素的影響，需要引入內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以減小誤差[8]。常用的內(nèi)參基因有Actin、18S rRNA、Ubiquitin-protein ligase（UBC）和glycer aldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）等。大量研究表明，內(nèi)參基因在不同植物、不同處理和組織中的表達(dá)穩(wěn)定性有較大差異[9-11]。因此，必須根據(jù)特定的試驗(yàn)條件，選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，以此提高試驗(yàn)的精確性。不同植物在鋁脅迫后的癥狀、耐受性以及相關(guān)基因的表達(dá)情況存在差異，然而針對(duì)鋁脅迫下不同內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性等研究還未見報(bào)道，大多數(shù)研究選擇常見的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進(jìn)行校正。例如Wu等[12]在探究甘藍(lán)BoMATE基因于不同鋁濃度處理下的表達(dá)情況時(shí)選用Actin作為內(nèi)參基因;Tian等[13]選擇Actin、GADPH作為內(nèi)參基因分析小麥根尖TaALMT1基因在鋁處理后不同時(shí)間段內(nèi)的表達(dá)情況。所選內(nèi)參基因能否準(zhǔn)確地反映目的基因在鋁脅迫下的表達(dá)情況以及哪些基因可作為鋁脅迫處理后橡膠苗根系特異性表達(dá)的內(nèi)參基因尚不清楚。因此，本研究選取橡膠樹的Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、UBC2（ubiquitin-protein ligase 2）、YLS8（mitosis protein YLS8）、GAPDH（glyceraldehyde-3-phos phate dehydrogenase）、UBC4（ubiquitin-protein ligase 4）、FP（F-box family protein）和ADF（actin depolymerizing factor）等10個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，以含0、200 mmol/L AlCl3的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)2、5 d的橡膠苗根系為材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并利用內(nèi)參基因分析軟件geNorm[14]、NormFinder[15]、BestKeeper[16] 、Delta Ct算法[17]以及綜合評(píng)價(jià)軟件RefFinder[18]對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析和評(píng)定，篩選出橡膠樹在鋁毒脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為橡膠樹耐鋁的分子機(jī)理研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選取橡膠樹‘熱研7-33-97兩蓬葉時(shí)期的組培苗作為試驗(yàn)材料，在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（內(nèi)含40 μmol/L的AlCl3，預(yù)防鋁處理后可能產(chǎn)生的休克作用，pH調(diào)至5.5）中預(yù)培養(yǎng)2 d。鋁脅迫處理（加入終濃度200 mmol/L的AlCl3·6H2O）和對(duì)照（不加鋁）的營(yíng)養(yǎng)液用1 mmol/L的HCl或氨水調(diào)節(jié)pH至4.2，每2 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，收集鋁脅迫處理2、5 d與對(duì)照的橡膠苗根系，液氮速凍后，于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取和cDNA合成? 不同時(shí)間段鋁處理和對(duì)照的橡膠苗根系總RNA采用天根生化科技有限公司（北京）生產(chǎn)的RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚植物總RNA試劑盒進(jìn)行提取，使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定。參考Fermentas公司的RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行合成，合成后于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 內(nèi)參基因的篩選與引物設(shè)計(jì)? 根據(jù)研究植物內(nèi)參基因的相關(guān)文獻(xiàn)和已公布橡膠樹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取橡膠樹的Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，交由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列等信息如表1所示。

1.2.3? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green染料法在CFX96 Real-time PCR System（Bio-Rad， United States）上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 L，包括SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa）10 L，上游和下游引物（10 mol/L）各0.4 L，30 ng/L的cDNA模板1 L，ddH2O 8.2 L，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR的反應(yīng)程序分為3步，第1步95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s;第2步60 ℃退火20 s;第3步72 ℃延伸30 s?？傆?jì)43個(gè)循環(huán)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀得到的Cq值計(jì)算2q，用內(nèi)參基因分析軟件geNorm（https：//genorm. cmgg.be/）、NormFinder（https：//moma.dk/normfin der-software）、BestKeeper（http：//www.Genequa tification.de//bestkeeper.html#descr）和Delta Ct算法以及RefFinder軟件綜合分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

geNorm軟件是基于Microsoft Excel平臺(tái)創(chuàng)建的VBA宏程序。穩(wěn)定參數(shù)M作為geNorm軟件分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的衡量標(biāo)準(zhǔn)，其參考臨界值為1.5，并且內(nèi)參基因的M值越低，說明其表達(dá)越穩(wěn)定，反之該基因的表達(dá)穩(wěn)定性越低。geNorm軟件還可以對(duì)候選內(nèi)參基因做標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析，組合差異值Vn/n+1的默認(rèn)閾值為0.15。若Vn/n+1<0.15， 表明只需n個(gè)基因作為內(nèi)參基因，無需引入第（n+1）個(gè)基因;如果Vn/n+1>0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)目是（n+1）個(gè)。

NormFinder軟件的工作原理是通過獲得組內(nèi)和組間方差值來表示候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，內(nèi)參基因的穩(wěn)定值（S）越小，表達(dá)穩(wěn)定性越高，反之越低。

BestKeeper軟件直接使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀得到的Cq值，通過對(duì)比各個(gè)候選內(nèi)參基因Cq值的標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation， SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation， CV）分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD值與CV值越小，穩(wěn)定性越好。

Delta Ct算法是通過計(jì)算樣品中成對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（average of standard deviation， STDEV）來比較候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，即平均標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定。

RefFinder軟件是根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct 4種軟件（算法）的結(jié)果賦予每個(gè)內(nèi)參基因合適的權(quán)重，計(jì)算其排序值的幾何平均數(shù)（geomean of ranking values），排序值的幾何平均數(shù)越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選內(nèi)參基因引物擴(kuò)增特異性分析

提取的所有RNA樣品經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)后，其A260/A280比值均在2.0左右，說明RNA無降解，質(zhì)量較好。以根系cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)表明，10個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶單一，特異性好，無引物二聚體產(chǎn)生，可用于后續(xù)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析（圖1）。

2.2? 候選內(nèi)參基因的Cq值分析

Cq值是指擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)在達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Cq值越大，表達(dá)豐度越低。如圖2所示，10個(gè)候選內(nèi)參基因的Cq值在鋁脅迫下的變化趨勢(shì)各不相同。10個(gè)候選內(nèi)參基因的Cq值處于16.41～32.68之間，其中FP的Cq值最大，表達(dá)豐度最低;18S rRNA的Cq值最小，表達(dá)豐度最高，其他候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度處于中間水平。

2.3? 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.3.1? geNorm和NormFinder軟件評(píng)估結(jié)果? ge Norm軟件通過計(jì)算穩(wěn)定參數(shù)M來評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，M值越低，表示該內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定。由圖3A可知，所選候選內(nèi)參基因的M值均低于1.5。10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低的次序?yàn)閁BC4=FP>40S rRNA>Actin7>Actin>ADF>UBC2>YLS8>GAPDH>18S rRNA。

橡膠樹10個(gè)候選內(nèi)參基因配對(duì)差異分析如圖4所示，V6/7<0.15說明只需要引入6個(gè)基因，不需要引入第7個(gè)基因來消除差異，適合鋁毒處理后作為內(nèi)參基因組合的有UBC4、FP、40S rRNA、Actin7、Actin和ADF。

NormFinder軟件表示內(nèi)參基因穩(wěn)定性的方式與geNorm軟件類似，不同之處是沒有規(guī)定參考臨界值。如圖3B所示，10個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值（S）從小到大依次為40S rRNA

2.3.2? Bestkeeper軟件評(píng)估結(jié)果? BestKeeper軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的方法是通過對(duì)比各個(gè)候選內(nèi)參基因Cq值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），SD與CV越小，穩(wěn)定性越好。使用Best- Keeper軟件分析橡膠樹10個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的結(jié)果如表2所示。可以看出，Actin7的SD和CV最小，表明其穩(wěn)定性最好。GAPDH的SD和CV最大，說明其穩(wěn)定性最差，不適合作為內(nèi)參基因使用。

2.3.3? Delta Ct算法分析結(jié)果? Delta Ct算法計(jì)算結(jié)果如圖5所示，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（STDEV）從小到大依次為40S rRNA

2.3.4? RefFinder軟件綜合評(píng)定結(jié)果? 為避免單一內(nèi)參基因評(píng)價(jià)軟件分析結(jié)果引起的誤差，使用RefFinder軟件對(duì)geNorm、NormFinder、Best Keeper和Delta Ct算法計(jì)算得到的結(jié)果進(jìn)行綜合排名。由RefFinder軟件計(jì)算得到的排序值的幾何平均數(shù)依次為UBC4（1.86）<40S rRNA（1.97）< FP（2.83）

綜合3種軟件geNorm、NormFinder、Best- Keeper 和Delta Ct算法以及RefFinder軟件的綜合評(píng)定結(jié)果可知，10個(gè)候選內(nèi)參基因中UBC4、40S rRNA、FP、Actin7和Actin的表達(dá)穩(wěn)定性較高，可作為內(nèi)參基因分析橡膠樹在鋁毒脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)情況，而GAPDH、18S rRNA、UBC2、ADF和YLS8的表達(dá)穩(wěn)定性較低，尤其是GAPDH不宜作為鋁脅迫下實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因使用。

2.3.5? 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證? 為了驗(yàn)證篩選得到的內(nèi)參基因在鋁脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性，選取表達(dá)穩(wěn)定性較高的UBC4、40S rRNA和FP基因以及3個(gè)基因的組合作為內(nèi)參基因?qū)ο鹉z樹鋁誘導(dǎo)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbALMT-1（NCBI登錄號(hào)：XM_021791834.1）和HbALMT-2（NCBI登錄號(hào)：XM_021796406.1）在鋁處理2 d（T2）和5 d（T5）以及未添加鋁處理2 d（C2）和5 d（C5）時(shí)的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，同時(shí)選取了表達(dá)穩(wěn)定性較差的GAPDH基因作為對(duì)照。如圖7所示，以UBC4、40S rRNA和FP作為內(nèi)參基因?qū)bALMT-1和HbALMT-2基因在鋁脅迫不同天數(shù)下的表達(dá)量進(jìn)行校正，發(fā)現(xiàn)鋁脅迫后兩基因的相對(duì)表達(dá)量均有所下降，并且處理5 d后的表達(dá)量低于處理2 d后的表達(dá)量。使用組合內(nèi)參基因UBC4+40S rRNA+FP對(duì)2個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，結(jié)果表現(xiàn)出與單獨(dú)使用一個(gè)內(nèi)參基因相同的變化趨勢(shì)。而以表達(dá)穩(wěn)定性較差的GAPDH基因作為內(nèi)參基因使用時(shí)，對(duì)目的基因的表達(dá)量均未能夠進(jìn)行準(zhǔn)確量化，甚至出現(xiàn)了嚴(yán)重偏差，如HbALMT-1基因在處理5 d時(shí)的表達(dá)量高于處理2 d時(shí)的表達(dá)量，HbALMT-2基因在處理2 d時(shí)的表達(dá)量高于對(duì)照，這與使用單個(gè)內(nèi)參基因以及組合內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進(jìn)行校正時(shí)的結(jié)果嚴(yán)重不符。這說明橡膠樹在鋁脅迫下選擇UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因組合作為內(nèi)參基因是適合的，選擇表達(dá)穩(wěn)定性較差的內(nèi)參基因則會(huì)出現(xiàn)較大偏差。

3? 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由于其快速、便捷、特異性高以及靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最常用的技術(shù)之一。但大量的試驗(yàn)結(jié)果表明，常用的內(nèi)參基因如Actin、18S rRNA、GAPDH和UBC等并非在所有物種、所有組織及試驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)[19-20]，故需要根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因。

鋁毒是酸性土壤上限制作物產(chǎn)量的主要因素，目前針對(duì)鋁毒脅迫下篩選內(nèi)參基因的相關(guān)研究還未見報(bào)道。研究人員大多選擇常見的內(nèi)參基因，如Maron等[21]研究玉米根系在不同時(shí)間段鋁處理后經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析選擇的19個(gè)基因的表達(dá)情況時(shí)，選擇18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，而在本研究中發(fā)現(xiàn)18S rRNA基因的表達(dá)穩(wěn)定性較差，不適合作為內(nèi)參基因使用，這可能與不同物種對(duì)鋁脅迫的響應(yīng)存在差異有關(guān)。除已進(jìn)行驗(yàn)證的UBC4、40S rRNA和FP基因作為內(nèi)參基因使用較為合理外，4種內(nèi)參基因評(píng)價(jià)軟件（算法）以及綜合評(píng)價(jià)軟件RefFinder的結(jié)果顯示，Actin和Actin7基因作為內(nèi)參基因使用時(shí)的表達(dá)穩(wěn)定性也較高，Grisel等[22]在研究鋁脅迫下白楊根中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況時(shí)也選擇了Actin作為內(nèi)參基因。GAPDH基因被廣泛地用作內(nèi)參基因使用，如Tian等[13]在研究鋁處理后不同時(shí)間段內(nèi)小麥根尖TaALMT1基因的表達(dá)情況時(shí)選擇GADPH作為內(nèi)參基因;朱友銀等[23]研究表明GAPDH基因可作為內(nèi)參基因在研究中國櫻桃低溫和鹽堿脅迫下的相關(guān)基因表達(dá)時(shí)使用。但本研究中GAPDH基因的表達(dá)穩(wěn)定性較差，利用其作為內(nèi)參基因使用時(shí)，可能會(huì)對(duì)目的基因的表達(dá)情況產(chǎn)生誤判;GAPDH在鹽脅迫下玉蘭各組織中的表達(dá)也不穩(wěn)定[24]。由此可見，選擇合適的內(nèi)參基因是保證實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提條件，合適的內(nèi)參基因要根據(jù)不同的研究目的、植物類型以及試驗(yàn)條件等進(jìn)行評(píng)價(jià)，方能保證實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

目前常用的內(nèi)參基因評(píng)價(jià)軟件（算法）有g(shù)eNorm、NormFinder、BestKeeper以及Delta Ct，由于各個(gè)軟件（算法）的計(jì)算原理不盡相同，導(dǎo)致內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序略有差異，尤其是BestKeeper軟件所得結(jié)果與其他3種軟件（算法）計(jì)算結(jié)果差別較大，如18S rRNA經(jīng)過BestKeeper軟件計(jì)算后排名第二，而在其他3個(gè)軟件（算法）計(jì)算結(jié)果中排名比較靠后，表達(dá)穩(wěn)定性較差，這表明僅利用一種軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性做出評(píng)價(jià)并不完全合理。因此，本研究利用綜合評(píng)價(jià)軟件RefFinder根據(jù)4種軟件（算法）的結(jié)果進(jìn)一步計(jì)算了10種候選內(nèi)參基因排序值的幾何平均值，發(fā)現(xiàn)UBC4、40S rRNA、FP、Actin7和Actin是排名前五的內(nèi)參基因，表明這5種基因的表達(dá)穩(wěn)定性較高，可作為內(nèi)參基因使用。ALMT（alu minum-induced malate transporter）基因的功能已在小麥[25]、玉米[26]、油菜[27]等多種植物中研究表明會(huì)響應(yīng)鋁脅迫，故本研究根據(jù)已經(jīng)篩選得到的UBC4、40S rRNA和FP基因以及geNorm軟件得到的配對(duì)差異分析結(jié)果，使用3個(gè)組合基因作為內(nèi)參基因?qū)bALMT-1和HbALMT-2基因在鋁脅迫不同天數(shù)下的表達(dá)量進(jìn)行了校正，進(jìn)一步證明了其作為內(nèi)參基因使用的可靠性。

鋁毒脅迫下包括橡膠樹在內(nèi)的很多植物內(nèi)參基因的篩選還未見報(bào)道，因此從提高橡膠樹在鋁毒脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性出發(fā)，本研究選取了Actin、Actin7、18S rRNA、40S r RNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10個(gè)內(nèi)參基因，分析這些內(nèi)參基因在鋁脅迫下不同時(shí)間段的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，UBC4、40S rRNA、FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因組合作為內(nèi)參基因?qū)τ诜治鱿鹉z樹在鋁毒脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)情況是比較合適的。但因?yàn)殇X毒對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)在根部，研究?jī)H比較了鋁脅迫處理下橡膠苗根系中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并未涉及其他器官。

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