邱麗芳 韋忠恒 黃贊松 張倬彬 趙立峰 覃小珊

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院， 廣西百色市 533000，電子郵箱:871975831@qq.com；右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2 腫瘤科，3 消化內(nèi)科，廣西百色市 533000)

原發(fā)性肝癌是全球?qū)е掳┬运劳龅牡诙蟀┌Y，肝癌治療難的主要原因在于腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[1]。人白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-33為一類處于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子，其屬于IL-1家族，是一種由受損或壞死的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)源性“警報素”[2]。Wei等[3]發(fā)現(xiàn)，IL-33 水平與HBsAg陰性的肝癌患者的患病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)，說明它可能是肝癌患者的保護(hù)性因素。IL-33的自身受體為致癌性抑制基因2，兩者相互結(jié)合后搭建相應(yīng)信號途徑，從而影響炎性反應(yīng)、腫瘤免疫與細(xì)胞免疫[4-6]。最近的研究顯示，IL-33/致癌性抑制基因2信號通路通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達(dá)，在多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要角色，包括腫瘤細(xì)胞增殖、局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、免疫原性等[7]，但其在肝癌中的生物學(xué)功能及其潛在作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在分析外源性 IL-33對人肝癌Hep3B細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲的影響，探討其可能的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥物 人肝癌Hep3B細(xì)胞株、Huh-7細(xì)胞株均來源于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞所;IL-33、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)由Sigma公司生產(chǎn)(批號：SRP4193、RNBG8041)，胎牛血清由Gibco公司生產(chǎn)(批號： 42F7180K)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)由HyClone公司生產(chǎn)(批號： SH30022.01)；胰酶(批號：89040101100 )、抗生素(嘌呤霉素，規(guī)格：2 μg/mL，批號：87020101100)均由Invitrogen公司生產(chǎn)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒由上海生工公司生產(chǎn)(批號：A600799-0005)；基質(zhì)膠及Transwell小室購自Corning 公司(批號：3413)。

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡購自奧林巴斯公司(型號：CKX41)；CO2恒溫培養(yǎng)箱由美國Thermo公司生產(chǎn)(型號：3111)；超凈工作臺(型號：BSC-1300-II-A2)與離心機(jī)(型號：TD6)購自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司； 液氮貯存罐購自樂山亞西機(jī)器廠；酶標(biāo)儀購自BioTek公司(型號：ELx800)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、濕度為100%、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)：Hep3B細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞均按照實(shí)驗(yàn)組(IL-33濃度為20 ng/L組、40 ng/L組、60 ng/L組)及對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取Hep3B細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞，用0.25%胰酶1 mL消化3 min，計(jì)數(shù)后接種于96孔板，接種密度為1×104個/孔，37℃培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液倒掉，各實(shí)驗(yàn)組分別加入3 mL相應(yīng)濃度的IL-33，對照組不加入IL-33(加入等量溶劑)。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。將MTT溶液(濃度為5 mg/mL)添加至孔板內(nèi)，0.02 mL/孔。在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將孔中上清液倒掉，各孔添加0.15 mL的DMSO，置于振蕩儀上振蕩10 min，使結(jié)晶體徹底溶解，使用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm時每個孔的吸光度值，每組重復(fù)3次，取平均值，記錄結(jié)果。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：Hep3B細(xì)胞與Huh-7細(xì)胞均按照實(shí)驗(yàn)組及對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取Hep3B細(xì)胞與Huh-7細(xì)胞，使用0.25%胰酶1 mL消化3 min，得到單細(xì)胞懸液后，接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為6×105個/孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，此時懸浮細(xì)胞幾乎全部融合。然后對孔內(nèi)細(xì)胞液進(jìn)行垂直劃痕，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞3次，約2 min/次，使得劃下細(xì)胞被清除。添加3 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，此時點(diǎn)記作0 h時，實(shí)驗(yàn)組再加入終濃度為60 ng/L的IL-33 0.18 ng(總體積為3 mL)，將等量培養(yǎng)液添加至對照組，培養(yǎng)條件同上。0 h及培養(yǎng)24 h后取樣、拍照、測量劃痕寬度并記錄，其中使用Adobe Illustrator CS6軟件測量劃痕寬度，計(jì)算遷移率，遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Hep3B細(xì)胞與Huh-7細(xì)胞均按照實(shí)驗(yàn)組及對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室放于24孔板中，依次放入0.3 mL無血清培養(yǎng)基以及0.06 mL基質(zhì)膠，充分混合，取0.1 mL混合液進(jìn)行人工基底膜的制備，在無菌環(huán)境下過夜處理。實(shí)驗(yàn)前重新成膠，取Hep3B細(xì)胞與Huh-7細(xì)胞，使用0.25%胰酶1 mL消化3 min后，用無血清培養(yǎng)基沖洗3次(約2 min/次)，同時進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后實(shí)驗(yàn)組加入0.18 ng IL-33(總體積為3 mL，終濃度為60 ng/L)，對照組不采取任何處理，37℃培養(yǎng)24 h后逐一取細(xì)胞懸液0.15 mL，分別接種于已成膠的Transwell小室內(nèi)。另取完整培養(yǎng)基，內(nèi)含DMEM+10%胎牛血清+雙抗0.6 mL添加至下室，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育1 d。將Transwell小室取出，使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，約2 min/次，之后使用多聚甲醛固定20 min，再用結(jié)晶紫染色液實(shí)施染色處理，時間約為20 min，由磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，約2 min/次，制片，通過顯微鏡查看膜下層腫瘤細(xì)胞，同時各組隨機(jī)確定5個視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次，取平均值，同時拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性 20 ng/L組、40 ng/L組、60 ng/L組的Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖活性均高于對照組(均P<0.05)，60 ng/L組的Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖活性高于20 ng/L組、40 ng/L組(均P<0.05)，但20 ng/L組與40 ng/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表1。

表1 4組Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的吸光度值(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與60 ng/L組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移率 實(shí)驗(yàn)組Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的遷移率均低于對照組(均P<0.05)，見表2及圖1。

表2 兩組人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的遷移率比較(x±s，%)

圖1 兩組人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞不同時間點(diǎn)的劃痕寬度

2.3 各組細(xì)胞的侵襲能力 實(shí)驗(yàn)組人肝癌Hep3B細(xì)胞與Huh-7細(xì)胞穿過 Transwell 小室的數(shù)量少于對照組(均P<0.05)，見表3及圖2。

表3 兩組人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的侵襲力比較(x±s，個/高倍視野)

圖2 兩組人Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

腫瘤中的炎癥細(xì)胞或免疫細(xì)胞，可以通過產(chǎn)生促腫瘤細(xì)胞因子和其他因子來影響腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤微環(huán)境中，IL-33被證實(shí)具有轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子雙重功能[2]。最近幾年，越來越多研究表明IL-33在惡性實(shí)體瘤中具有促腫瘤作用，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管增生，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等。例如，Wang等[8]通過轉(zhuǎn)染IL-33表達(dá)載體，分析其生長和侵襲情況，發(fā)現(xiàn)IL-33的激活促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；Yu等[9]發(fā)現(xiàn)，IL-33具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲與遷移的作用，并呈劑量依賴性；Wu等[10]發(fā)現(xiàn)，IL-33通過與其受體致癌性抑制基因2結(jié)合和激活c-Jun氨基末端激酶信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，且在腎癌組織中的IL-33表達(dá)增高，與疾病分期、預(yù)后相關(guān)；此外，IL-33在人大腸癌組織中的表達(dá)上調(diào)，其通過重塑腫瘤微環(huán)境和誘導(dǎo)腫瘤血管生成，對結(jié)腸癌形成與肝轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性[11-12]。然而，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-33在實(shí)體瘤中表現(xiàn)為抗腫瘤作用，例如Chen等[13]發(fā)現(xiàn) IL-33可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用。由此可見，IL-33在不同的生物學(xué)環(huán)境或不同的腫瘤中的作用不同且較為復(fù)雜。研究表明，肝癌患者血清IL-33表達(dá)水平較健康人群升高，已發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者IL-33的表達(dá)水平高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者[14-15]。但目前國內(nèi)外涉及IL-33與肝癌相關(guān)性的研究不多，了解IL-33在肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中的作用，將有助于充分發(fā)揮其在抗癌治療中的潛力。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，IL-33在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織[16]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討IL-33對人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，20 ng/L組、40 ng/L組、60 ng/L組的Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖活性均高于對照組(均P<0.05)，提示不同濃度外源性IL-33 均可促進(jìn)人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖；60 ng/L組的Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖活性高于20 ng/L組、40 ng/L組(均P<0.05)，但20 ng/L組與40 ng/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示適當(dāng)提高IL-33濃度可增強(qiáng)其促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞遷移率及侵襲能力均降低(均P<0.05)，這表明外源性的IL-33可抑制人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞的遷移與侵襲行為。本研究結(jié)果表明，IL-33可對肝癌細(xì)胞增殖施以促進(jìn)作用，同時還能夠使此類細(xì)胞的侵襲與遷移行為減弱，提示其在肝癌中表現(xiàn)出促癌及抑癌雙重作用，與目前國內(nèi)外關(guān)于IL-33對多數(shù)實(shí)體瘤作用的研究結(jié)果[10,17-18]相似。針對IL-33具有促癌和抑癌雙重作用的特點(diǎn)，部分研究者認(rèn)為 IL-33促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是通過激活核因子κB 信號通路，誘導(dǎo)金屬蛋白酶及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的增加，以誘導(dǎo)腫瘤血管的生成,提升腫瘤細(xì)胞的侵襲與生長水平[19]。 此外，核因子κB的亞基P65還可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改變細(xì)胞性質(zhì)和細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致各細(xì)胞間黏附力減弱甚至消失，由此使癌細(xì)胞遷移增強(qiáng)[20]。另有學(xué)者認(rèn)為，IL-33的抗腫瘤作用是通過誘導(dǎo)核因子κB通路的活化，使得自然殺傷細(xì)胞以及CD8+T淋巴細(xì)胞亞群CD69水平上調(diào)，從而導(dǎo)致這兩類細(xì)胞活化，對免疫反應(yīng)施以調(diào)控，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤目的[21]。 除此之外，IL-33 還通過刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞1產(chǎn)生干擾素γ,進(jìn)而刺激自然殺傷T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1 型免疫活動，共同發(fā)揮抗腫瘤作用[22]?？梢?，在不同的腫瘤微環(huán)境中,IL-33對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的作用是不同的，無論是作為促癌基因還是抑癌基因，IL-33對于肝癌的增值、侵襲與遷移均存在一定影響性。

綜上所述， IL-33可促進(jìn)人肝癌Hep3B細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞增殖，同時又可抑制其遷移、侵襲。IL-33可能在肝癌形成與發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用，但其在體內(nèi)的作用并未闡明。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是在一個相互影響、相互作用的有機(jī)整體環(huán)境下進(jìn)行的，故后續(xù)我們將進(jìn)行一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索IL-33 在體內(nèi)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期尋找靶向治療肝癌的靶點(diǎn)。